鋅指蛋白281對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響

陳華劍， 張欽紅， 張 薇

(重慶市急救醫(yī)療中心檢驗(yàn)科， 重慶 400014)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常見(jiàn)的惡性腫瘤。2012年新診斷的患者約有782 000例，其中約有50%發(fā)生在中國(guó)，肝細(xì)胞癌的預(yù)后極差，在全球各種惡性腫瘤中死亡率位居第二，2012年約有746 000例患者死亡[1]。起病隱匿、放化療效果差是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌預(yù)后不良的主要原因[2]，因此，研究HCC發(fā)生發(fā)展以及惡性增殖的分子機(jī)制具有十分重要的意義。鋅指蛋白(zinc finger protein,ZFP)是一類(lèi)具有手指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，最初被發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中[3]?，F(xiàn)已知ZFP分布廣泛，人類(lèi)基因組中有約1%的序列編碼有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)[4]。鋅指蛋白281(ZNF281)也可稱(chēng)之為ZBP-99，其基因位于1號(hào)染色體，參與調(diào)控胚胎干細(xì)胞的分化與組織的發(fā)育[5]。近年來(lái)，ZNF281還被鑒定為與致癌基因c-MYC相關(guān)[6]。在結(jié)腸癌與胰腺癌中，ZNF281也發(fā)揮著重要的作用[7-9]。目前對(duì)于ZNF281在肝細(xì)胞癌中的作用尚無(wú)報(bào)道。基于上述原因，我們將對(duì)ZNF281在肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用展開(kāi)研究。在本研究中，我們首先檢測(cè)了在80例健康人群及206例肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中ZNF281的 mRNA表達(dá)水平，并將其與多個(gè)臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析；接下來(lái)，我們檢測(cè)了ZNF281在肝癌細(xì)胞和永生化肝細(xì)胞中的mRNA及蛋白表達(dá)水平，并在肝癌細(xì)胞中利用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)靶向沉默ZNF281的表達(dá)，觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響。

材 料 和 方 法

1 材料

隨機(jī)收集重慶市急救醫(yī)療中心檢驗(yàn)科2015年1月～2016年12月間206例肝癌患者的外周血。80例健康人群對(duì)照組外周血來(lái)自隨機(jī)抽取的健康體檢中心門(mén)診。人外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；肝癌細(xì)胞系Huh-7購(gòu)于日本人類(lèi)科學(xué)研究資源庫(kù)(Humon Science Research Resources Bank，HSRRB)；肝癌細(xì)胞系PLC/PRF/5、SK-Hep-1和SMMC-7721及永生化肝細(xì)胞系MIHA購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(American Type Culture Collection，ATCC)；非靶向?qū)φ誷iRNA(siCont)及靶向沉默ZNF281的siRNA(siZNF281)由銳博公司合成；轉(zhuǎn)染試劑HiPerFect Transfection Reagent購(gòu)于QIAGEN；RNA提取TRIzol試劑購(gòu)于Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Bio-Rad；FastStart Essential DNA Green Master Mix購(gòu)于Roche；抗ZNF281抗體購(gòu)于Sigma；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG及NC膜購(gòu)于GE；抗β-actin抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology；BCA試劑盒購(gòu)于Thermo；CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑購(gòu)于Promega；Cell-LightTMEdU Apollo?488InVitroImaging Kit試劑盒購(gòu)于銳博公司。

2 方法

2.1單個(gè)核細(xì)胞的分離提取 向羅口試管中加入淋巴細(xì)胞分離液，再加入等體積血液樣本于分離液的液面上，水平離心機(jī)離心，500×g離心30 min后，羅口試管中液體分為4層，從上到下依次為血漿層、環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層、透明分離液層和紅細(xì)胞層。小心吸取第2層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞層到另一羅口試管中，并用生理鹽水洗滌。

2.2細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞系Huh-7、PLC/PRF/5、SK-Hep-1和SMMC-7721及永生化肝細(xì)胞系MIHA均于含10% 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和1% 青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于含有5% CO2、37 ℃孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.3siRNA轉(zhuǎn)染 接種SK-Hep-1細(xì)胞6×104和Huh-7細(xì)胞1.2×105至6孔板中，24 h后更換為無(wú)抗生素的DMEM+10% FBS。并將siRNA(終濃度為10 nmol/L)與轉(zhuǎn)染試劑12 μL加入100 μL Opti-MEM中充分混勻，靜置10 min后逐滴滴入6孔板中。轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)使用之前已明確有效的siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染并檢測(cè)沉默效率，若抑制率高則可說(shuō)明轉(zhuǎn)染效率高且檢測(cè)方法正常。

2.4RNA的提取及real-time PCR 將單個(gè)核細(xì)胞，肝癌細(xì)胞Huh-7、PLC/PRF/5、SK-Hep-1和SMMC-7721，永生化肝細(xì)胞MIHA以及轉(zhuǎn)染siRNA后的細(xì)胞以1 mL TRIzol裂解，用200 μL氯仿萃取RNA，并用異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌。干燥，去RNase水溶解后取1 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。接著進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參照，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 2 min；95 ℃ 20 s、60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s,34個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。β-actin的上游引物序列為5’-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT-3’，下游引物序列為5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’； ZNF281的上游引物序列為5’-AGCACCACCGTGACGTATTA-3’，下游引物序列為5’-AGATGCACTTGGCTTCCTCT-3’。

2.5Western blot實(shí)驗(yàn) 將肝癌細(xì)胞Huh-7、PLC/PRF/5、SK-Hep-1和SMMC-7721，永生化肝細(xì)胞MIHA以及轉(zhuǎn)染siRNA后的細(xì)胞用適量含PI的RIPA裂解液裂解，4 ℃搖床裂解20 min，16 000×g離心5 min，移液器挑出黏液沉淀物質(zhì)?？偟鞍诐舛扔葿CA試劑盒檢測(cè)，SDS-PAGE每孔上樣30 μg總蛋白，待蛋白分離后將其轉(zhuǎn)至NC膜，5% 脫脂牛奶封閉1 h。4 ℃搖床孵育 I 抗過(guò)夜，室溫孵育 II 抗2 h。以β-actin為內(nèi)參照。

2.6MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 轉(zhuǎn)染SK-Hep-1細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞24 h后將siCont組與siZNF281組細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，并分別接種6 000個(gè)細(xì)胞至96孔板中。于轉(zhuǎn)染2 d、3 d、4 d和5 d后分別向96孔板中加入20 μL MTS試劑，并置于37 ℃ 孵育1 h后490 nm檢測(cè)吸光度。檢測(cè)儀器為購(gòu)于BioTek的Synergy H1 Microplate Reader。

2.7EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn) 接種SK-Hep-1細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞前分別將蓋玻片置于6孔板中，轉(zhuǎn)染3 d后用多聚甲醛固定并進(jìn)行EdU實(shí)驗(yàn)，具體按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.8平板集落形成實(shí)驗(yàn) 轉(zhuǎn)染SK-Hep-1細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞24 h后分別將siCont組與siZNF281組細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，并分別接種2 000個(gè)細(xì)胞至6孔板中，每3 d換液一次。待肉眼觀察到明顯集落時(shí)用冰甲醇固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色。

2.9軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn) 將含有20% FBS的2×DMEM與濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠充分混勻后作為下層膠。轉(zhuǎn)染SK-Hep-1細(xì)胞和Huh-7細(xì)胞24 h后將siCont組與siZNF281組細(xì)胞消化至含有20% FBS的2×DMEM中進(jìn)行計(jì)數(shù)，制備每孔2 000個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，并與0.7%瓊脂糖凝膠混勻作為上層膠。每3 d向6孔板中滴入幾滴完全培養(yǎng)基以保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供給。3周后，待肉眼可觀察到明顯集落后用0.05% 結(jié)晶紫染色。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn);兩樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn);多組樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，其兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ZNF281在健康人群及肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)差異

提取健康人及肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的RNA后進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，在健康人樣本中，ZNF281 mRNA相對(duì)表達(dá)水平為1.040±0.069，在肝癌患者樣本中，ZNF281 mRNA相對(duì)表達(dá)水平為8.451±0.846，在肝癌患者中，ZNF281的mRNA表達(dá)水平顯著高于健康人群(P<0.01),見(jiàn)圖1。我們將肝癌患者單個(gè)核細(xì)胞中ZNF281 mRNA表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示ZNF281的mRNA表達(dá)水平與腫瘤的大小(P=0.002 9)、分期(P=0.004 3)及血管侵襲性呈正相關(guān)(P=0.001 3),但與患者的性別、年齡，腫瘤的個(gè)數(shù)、分級(jí)、壞死，以及肝硬化無(wú)相關(guān)性，見(jiàn)表1。

2 ZNF281在肝癌細(xì)胞和永生化肝細(xì)胞中的表達(dá)差異

基于上述ZNF281在臨床樣本中的表達(dá)情況，我們進(jìn)一步利用real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ZNF281在肝癌細(xì)胞和永生化肝細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示ZNF281在肝癌細(xì)胞系中的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于永生化肝細(xì)胞(P<0.01),見(jiàn)圖2。

Figure 1. The mRNA expression levels of ZNF281 in the peri-pheral blood mononuclear cells.**P<0.01vsheal-thy people.

圖1外周血單個(gè)核細(xì)胞中ZNF281的mRNA表達(dá)水平

表1ZNF281的mRNA表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

Table 1. Correlations between ZNF281 mRNA expression and clinicopathologic parameters

ClinicopathologicparameternZNF281expressionLowHighPSex2060.6855 Female351124 Male17148123Age(year)2060.2534 ≤50761660 >501303793Tumorsize(cm)2060.0029 ≤3542232 >315229123Tumornumber2060.5958 =114739108 >1591346Tumorgrade2060.9604 121912 21506189 3351520Tumorstage2060.0043 1421626 2891970 375966Vascularinvasion2060.0013 No14141100 Yes65659Tumornecrosis2060.5266 No882167 Yes1183385Cirrhosis2060.8744 No642143 Yes1424993

Figure 2. The mRNA and protein expression level of ZNF281 in hepatoma cell lines and immortalized hepatocytes. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsMIHA group.

圖2肝癌細(xì)胞及永生化肝細(xì)胞中ZNF281的表達(dá)水平

3 ZNF281可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的活力

用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siRNA沉默ZNF281的效率，結(jié)果顯示Huh-7和SK-Hep-1中的沉默效率分別約為80%和50%，見(jiàn)圖3A。并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行MTS實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示沉默ZNF281可顯著抑制肝癌細(xì)胞的存活率(P<0.01)，見(jiàn)圖3B。

Figure 3. The effect ofZNF281 silencing on the viability of HCC cells. A: the silencing ofZNF281 determined by Western blot analysis; B: the viability of HCC cells determined by MTS assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiCont group.

圖3MTS實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默ZNF281對(duì)肝癌細(xì)胞活力的影響

4 ZNF281可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的DNA合成能力

DNA合成能力增強(qiáng)是細(xì)胞惡性增殖的重要表現(xiàn)之一，EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沉默ZNF281可顯著抑制肝癌細(xì)胞的DNA合成能力，抑制率達(dá)55%(P=0.000 8)及44%(P=0.002 5)，見(jiàn)圖4。這一結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明了沉默ZNF281確實(shí)可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力。

Figure 4. The effect ofZNF281 silencing on the DNA synthesis of the HCC cells detected by EdU incorporation assay (×400). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiCont group.

圖4EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默ZNF281對(duì)肝癌細(xì)胞DNA合成能力的影響

5 ZNF281可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的集落形成能力及錨定非依賴(lài)生長(zhǎng)能力

平板集落實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示沉默ZNF281可顯著抑制肝癌細(xì)胞的集落形成能力，抑制率達(dá)65%(P=0.000 2)及53%(P=0.000 5),見(jiàn)圖5。軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)反映細(xì)胞的錨定非依賴(lài)生長(zhǎng)能力，結(jié)果顯示沉默ZNF281可顯著抑制肝癌細(xì)胞的錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)能力，抑制率達(dá)59%(P=0.000 2)及47%(P=0.001 5)，見(jiàn)圖6。

討 論

鋅指蛋白ZNF281與ZBP-89被報(bào)道具有極大的相似性，ZBP-89參與調(diào)控了細(xì)胞的增殖、凋亡、分化以及腫瘤的形成[10-13]。目前對(duì)ZNF281的研究顯示，在胚胎干細(xì)胞的自我更新、分化以及靜止期中，ZNF281都發(fā)揮了不同的重要作用[14-15]。近年來(lái)，ZNF281在腫瘤中的作用引起了研究者們的重視，在結(jié)腸癌中，ZNF281可促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithe-lial-mesenchymal transition, EMT)，增加結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力;在胰腺癌中，ZNF281可激活Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。在本研究中，我們檢測(cè)了80例健康人及206例肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中ZNF281的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ZNF281在肝癌病人的單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康人群。Real-time PCR與Western blot檢測(cè)ZNF281在肝癌細(xì)胞系和永生化肝細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果也顯示ZNF281在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于永生化肝細(xì)胞。以上結(jié)果說(shuō)明ZNF281在肝癌細(xì)胞中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，提示其有可能作為一種腫瘤促進(jìn)因子發(fā)揮作用。ZNF281與Snail和miR-34之間存在的共同調(diào)節(jié)為我們解析為何ZNF281在肝癌細(xì)胞中表達(dá)升高奠定了基礎(chǔ)。將206例肝癌病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中ZNF281的mRNA表達(dá)水平與多個(gè)臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，表達(dá)量異常升高的ZNF281與腫瘤的大小、腫瘤的分期以及腫瘤的血管侵襲性相關(guān)，這為我們進(jìn)一步檢測(cè)沉默ZNF281對(duì)肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響提供了依據(jù)。在Huh-7和SK-Hep-1細(xì)胞中沉默ZNF281的表達(dá)可顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，DNA合成能力，集落形成能力以及錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)能力。平板集落實(shí)驗(yàn)的改變主要表示了細(xì)胞獨(dú)立生存能力的改變，它僅對(duì)于集落形成提供信息；所以接下來(lái)，我們進(jìn)行了軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)，它除了對(duì)細(xì)胞的集落形成提供信息，也顯示了細(xì)胞的錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)能力和主動(dòng)移動(dòng)能力與其惡性程度和侵襲能力相關(guān)。這就從功能上驗(yàn)證了ZNF281確實(shí)可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。影響腫瘤細(xì)胞增殖的原因復(fù)雜，凋亡減少，周期改變等等均可導(dǎo)致細(xì)胞增殖加速。有文獻(xiàn)證實(shí)缺失ZNF281可以誘導(dǎo)G0/G1期阻滯，從而抑制細(xì)胞的增殖,且Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著十分重要的作用[9]。這為我們下游的機(jī)制研究提供了重要依據(jù)。

Figure 5. The effect ofZNF281 silencing on the ability of colony formation in HCC cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiCont group.

圖5平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默ZNF281對(duì)肝癌細(xì)胞集落形成能力的影響

Figure 6. The effect ofZNF281 silencing on the ability of anchorage-independent growth in HCC cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiCont group.

圖6軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)沉默ZNF281對(duì)肝癌細(xì)胞錨定非依賴(lài)性生長(zhǎng)能力的影響

綜上所述，本研究證實(shí)了ZNF281在肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中具有促進(jìn)腫瘤增殖的作用，為下一步開(kāi)展研究奠定了極好的基礎(chǔ)，也為更深入解析肝細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的復(fù)雜機(jī)制做出了貢獻(xiàn)，并且對(duì)肝細(xì)胞癌個(gè)性化治療提供了有利依據(jù)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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