青藤堿抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞活力、遷移和侵襲*

王新榮， 張印坡， 張延新

(1鄭州市婦幼保健院婦產(chǎn)科， 河南 鄭州 450012； 2漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校病理學(xué)教研室， 河南 漯河 462002)

卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅位于宮頸癌之后居第2位，然而其病死率卻位居首位，預(yù)計(jì)2017年美國(guó)卵巢癌的發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)將分別達(dá)到22 440例和14 080例[1]。由于卵巢癌早期癥狀隱匿，缺乏有效敏感的診斷方法，大多數(shù)卵巢癌患者初次診斷時(shí)已發(fā)展到了III～I(xiàn)V期，5年生存率僅為30%[2]。盡管大部分卵巢癌患者對(duì)以鉑類為基礎(chǔ)的初始化療有效，但通常會(huì)在18個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)，且二線化療的有效率僅為10%～20%[3]。于是從天然植物化學(xué)成分中尋找安全有效的新型抗腫瘤藥物成為研究的熱點(diǎn)。青藤堿(sinomenine)是從中藥青風(fēng)藤中提取出的一種生物堿單體，具有抗炎、降壓、鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)咳等藥理作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可抑制多種惡性腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，如乳腺癌[4]、肺癌[5]和骨肉瘤[6]等。然而目前尚無青藤堿影響人卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲的相關(guān)報(bào)道。為此我們觀察了青藤堿對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖和侵襲的影響并探究及其分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

人卵巢癌SKOV3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；人正常卵巢上皮IOSE80細(xì)胞購(gòu)自上海拜力生物科技有限公司。青藤堿(批號(hào)110774-200507，純度≥99.5%)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone；CCK-8試劑盒、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液、結(jié)晶紫染色液、RIPA裂解液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Matrigel和Transwell小室購(gòu)自Corning；小鼠抗人細(xì)胞周期蛋白(cyclin)A、cyclin D1、E-cadherin、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)和β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自Santa Cruz。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌SKOV3細(xì)胞和人正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE80采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，以0.25 %的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。

2.2青藤堿工作液的配制 將青藤堿溶于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，配制成濃度為50 mmol/L的貯存液，避光，4 ℃保存?zhèn)溆?。使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液將其分別稀釋至0.25、0.5、1、2和4 mmol/L。對(duì)照(control)組使用無藥的細(xì)胞培養(yǎng)液。

2.3CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞和IOSE80細(xì)胞，以每孔5 000個(gè)接種于96孔板，在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。2組細(xì)胞分別經(jīng)不同濃度青藤堿(0.25、0.5、1、2和4 mmol/L)處理48 h或經(jīng)2 mmol/L青藤堿處理12、24和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃培養(yǎng)1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)調(diào)零孔和對(duì)照孔。細(xì)胞活力(%)=加藥孔A值/對(duì)照孔A值×100%。同時(shí)使用SPSS 16.0軟件Probit回歸模型計(jì)算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 SKOV3細(xì)胞經(jīng)不同濃度青藤堿(0、0.25、0.5和1 mmol/L)處理48 h后，PBS洗滌2次，加入1 mL 70%冰乙醇于4 ℃固定24 h，PBS洗滌2次，加入PI染色液，4 ℃避光染色30 min，送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.5Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 將Transwell小室置于24孔板中，向小室下方的24孔板中加入600 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，向小室內(nèi)加入200 μL事先配制好的細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液用含有不同濃度(0、0.25、0.5和1 mmol/L)青藤堿的無血清RPMI-1640培養(yǎng)液制備，濃度為2×108/L。每個(gè)濃度設(shè)3復(fù)孔，在常規(guī)條件下培養(yǎng)12 h。取出小室，用棉簽擦去小室內(nèi)的細(xì)胞，PBS洗滌2次，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min，PBS 洗滌2次。顯微鏡下觀察小室下表面附著的遷移細(xì)胞，隨機(jī)挑選5個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)，取其平均值。遷移率 (migration rate，MR; %)=藥物組遷移細(xì)胞數(shù)/無藥組遷移細(xì)胞數(shù)×100%。

2.6Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 方法與Transwell遷移實(shí)驗(yàn)基本相同，只是需要提前將Matrigel與RPMI-1640培養(yǎng)基按1∶6稀釋，取50 μL均勻鋪到Transwell小室的底部，然后將Transwell小室放入24孔板中，于37 ℃孵育過夜使其成凝膠狀。此時(shí)在小室下表面觀察到的為侵襲細(xì)胞。侵襲率(invasion rate，IR; %)=藥物組侵襲細(xì)胞數(shù)/無藥組侵襲細(xì)胞數(shù)×100%。

2.7Western blot法檢測(cè)蛋白水平 用RIPA裂解細(xì)胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，取25 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用封閉液(5% BSA/TBST)封閉1 h，加入抗cyclin A、cyclin D1、CDK2、E-cadherin、MMP-9和β-actin等I抗(1∶200稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入II抗(1∶100稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，暗室X膠片顯影，拍照，使用ImageJ 1.45s軟件進(jìn)行灰度分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 青藤堿對(duì)SKOV3和IOSE80細(xì)胞活力的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著青藤堿作用濃度和作用時(shí)間的增加，SKOV3細(xì)胞活力逐漸降低(P<0.05)，青藤堿作用SKOV3細(xì)胞48 h的IC50為2.12 mmol/L；與此同時(shí)，雖然人正常卵巢上皮IOSE80細(xì)胞活力也有所下降(P<0.05)，但青藤堿作用SKOV3細(xì)胞48 h的IC50高達(dá)17.35 mmol/L。這表明與IOSE80細(xì)胞相比，青藤堿對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞活力具有較強(qiáng)的抑制作用，且呈劑量和時(shí)間依賴性，見圖1、2。

Figure 1. The effect of sinomenine at different concentrations for 48 h on the viability of SKOV3 and IOSE80 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.5 mmol/L group;△P<0.05vs1 mmol/L group;▲P<0.05vs2 mmol/L group.

圖1不同濃度青藤堿對(duì)SKOV3和IOSE80細(xì)胞活力的影響

Figure 2. The effect of 2 mmol/L sinomenine for different time on the viability of SKOV3 and IOSE80 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 h group;#P<0.05vs12 h group;△P<0.05vs24 h group.

圖2青藤堿作用不同時(shí)間對(duì)SKOV3和IOSE80細(xì)胞活力的影響

2 青藤堿對(duì)SKOV3細(xì)胞周期分布的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，分別經(jīng)0.25、0.5和1 mmol/L青藤堿處理48 h后，G0/G1期和S期的細(xì)胞比例逐漸升高(P<0.05)，G2/M期的細(xì)胞比例逐漸下降(P<0.05)。這表明青藤堿可劑量依賴地誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞發(fā)生G0/G1期和S期阻滯，見圖3。

3 青藤堿對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)0.25、0.5和1 mmol/L青藤堿處理12 h后，SKOV3細(xì)胞的遷移率和侵襲率均逐漸降低(P<0.05),這表明青藤堿可抑制SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲，且呈劑量依賴性,見圖4、5。

Figure 3. The effect of sinomenine on the cell cycle distribution of SKOV3 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.25 mmol/L group;△P<0.05vs0.50 mmol/L group.

圖3青藤堿對(duì)SKOV3細(xì)胞周期的影響

4 青藤堿對(duì)cyclin A、cyclin D1、E-cadherin和MMP-9蛋白水平的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，經(jīng)0.25、0.5和1 mmol/L青藤堿處理24 h后，SKOV3細(xì)胞中的cyclin A、cyclin D1和MMP-9蛋白水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性,見圖6、7。

Figure 4. Sinomenine inhibited the migration ability of SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.25 mmol/L group;△P<0.05vs0.5 mmol/L group.

圖4青藤堿抑制SKOV3細(xì)胞遷移

Figure 5. Sinomenine inhibited invasion ability of SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.25 mmol/L group;△P<0.05vs0.5 mmol/L group.

圖5青藤堿抑制SKOV3細(xì)胞侵襲

Figure 6. The effect of sinomenine on the protein levels of cyclin A and cyclin D1 in the SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.25 mmol/L group;△P<0.05vs0.5 mmol/L group.

圖6青藤堿對(duì)cyclinA和cyclinD1蛋白水平的影響

Figure 7. The effect of sinomenine on the protein levels of E-cadherin and MMP-9 in the SKOV3 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 mmol/L group;#P<0.05vs0.25 mmol/L group;△P<0.05vs0.5 mmol/L group.

圖7青藤堿對(duì)E-cadherin和MMP-9蛋白水平的影響

討 論

一直以來，青藤堿因具有抗炎、抗風(fēng)濕和免疫抑制等作用在臨床上用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病[7-8]。近年來，青藤堿的抗腫瘤作用日益受到人們的關(guān)注。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡并抑制其增殖。青藤堿與化療藥物聯(lián)用還可逆轉(zhuǎn)多種腫瘤細(xì)胞耐藥性[10-12]。此外，青藤堿還可抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲[4-6]。然而青藤堿對(duì)卵巢癌是否也具有抑制作用目前上不明確。在本研中，我們采用CCK-8法檢測(cè)了青藤堿對(duì)SKOV3和IOSE80細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示青藤堿作用SKOV3和IOSE80細(xì)胞48 h 的IC50分別為2.12 mmol/L和17.35 mmol/L，這表明青藤堿對(duì)人正常卵巢上皮IOSE80細(xì)胞的毒性作用較弱，但對(duì)人卵巢癌SKOV3細(xì)胞具有較強(qiáng)的毒性作用，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

Xie等[6]研究發(fā)現(xiàn)，青藤堿可通過上調(diào)Chk2蛋白磷酸化水平和p21蛋白表達(dá)水平，下調(diào)cyclin A和CDK2蛋白表達(dá)水平，導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生S期和G2/M期阻滯，從而抑制肉瘤細(xì)胞增殖。Li等[9]研究表明，青藤堿可下調(diào)cyclin D1、cyclin E和CDK4蛋白表達(dá)以及上調(diào)p21和p27蛋白表達(dá)，使乳腺癌細(xì)胞阻滯于G0/G1期。在本研究中我們也發(fā)現(xiàn)，青藤堿可劑量依賴地誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞發(fā)生G0/G1期和S期阻滯。

為探究青藤堿引起SKOV3細(xì)胞發(fā)生G0/G1期和S期阻滯的分子機(jī)制，我們觀察了青藤堿對(duì)G0/G1和S期的特征性cyclin蛋白表達(dá)水平的影響。本研究結(jié)果顯示，青藤堿可劑量依賴地下調(diào)cyclin D1和cyclin A的蛋白水平。Cyclin D1可激活CDK4和CDK6，促使細(xì)胞完成G1/S期轉(zhuǎn)換[13]。Cyclin D1表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致SKOV3細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯[14]。進(jìn)入S期后，cyclin A先與CDK2結(jié)合，參與DNA復(fù)制的進(jìn)行，在S期晚期，cyclin A與CDK1結(jié)合，使細(xì)胞進(jìn)入G2期[15]。本研究結(jié)果表明，青藤堿可能通過抑制cyclin D1和cyclin A蛋白表達(dá)，使CDK4、CDK6和CDK2活化受阻，從而導(dǎo)致SKOV3細(xì)胞發(fā)生G0/G1期和S期阻滯。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮著重要作用[16]。EMT是指細(xì)胞通過去分化由多邊形上皮樣形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮伍g葉性細(xì)胞形態(tài)，從而更具運(yùn)動(dòng)能力的過程。E-cadherin蛋白表達(dá)減少是癌細(xì)胞發(fā)生EMT的一個(gè)主要特征，E-cadherin是一種鈣依賴性的細(xì)胞黏附分子，在維持癌細(xì)胞上皮樣形態(tài)中扮演著重要角色[17]。已有研究證實(shí)，下調(diào)E-cadhe-rin蛋白表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲[18]。發(fā)生EMT的卵巢癌SKOV細(xì)胞還可分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，降解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而向周邊侵襲[19]。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)青藤堿可劑量依賴地抑制SKOV3細(xì)胞遷移和侵襲，這可能與青藤堿上調(diào)E-cadherin蛋白水平和下調(diào)MMP-9蛋白水平有關(guān)。

綜上所述，青藤堿可在體外抑制人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的活力、遷移和侵襲，這可能與青藤堿下調(diào)cyclin D1、cyclin A和MMP-9蛋白水平，以及上調(diào)E-cadherin蛋白水平有關(guān)，具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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