2015-2016年云南省瘧疾實驗室診斷質量及影響因素分析

， ，徐春，，

瘧疾是由媒介按蚊傳播的熱帶傳染病之一。2015年全球共報告2.14億瘧疾病例，主要分布于非洲地區(qū)[1]。云南省自2010年啟動消除瘧疾項目以來，加大對瘧疾的防控力度，瘧疾病例轉變?yōu)橐苑侵藓蜄|南亞國家為主要輸入病例來源為主[2]。對瘧疾病例的正確診斷是進行監(jiān)測、治療、媒介處置及開展病例溯源、病例確證等一系列防治工作的根本[3]。世界衛(wèi)生組織在《消除瘧疾現(xiàn)場手冊》中對消除瘧疾國家論證的11項主要內容中，也有5項內容涉及以診斷的正確性作為基礎[4]。云南省瘧疾診斷參比實驗室(下文簡稱省參比實驗室)作為首批通過國家瘧疾診斷參比實驗室認證的檢測機構，自2012年開始對全省通過國家疾病監(jiān)測信息管理系統(tǒng)上報的云南省瘧疾病例(下文簡稱網(wǎng)報病例)進行確診復核。本文就云南省參比實驗室對2015-2016年網(wǎng)報瘧疾病例的診斷質量進行評價，并對診斷影響因素進行分析。

1 材料與方法

1.1樣本及相關信息收集 2015年和2016年通過國家疾病監(jiān)測信息管理系統(tǒng)上報的云南省瘧疾病例縣(區(qū))或州(市)疾病預防控制中心采集網(wǎng)報病例血樣，填寫個案調查表，制作瘧疾血涂片和濾紙血膜樣本，將血片和濾紙血膜樣本及個案調查表統(tǒng)一送至省參比實驗室。

病例確認實驗方法 病例診斷準確性評價。由省參比實驗室專業(yè)技術人員根據(jù)參考文獻[4-7]采用雙盲法分別對病例血樣進行顯微鏡檢法和nested-PCR法雙人檢測。同時對血片制作質量進行定量評價。

1.2 評價指標

1.2.1血樣采集覆蓋率及采樣及時性指標 收樣率=上報病例樣本數(shù)/網(wǎng)報病例總數(shù)×100%,發(fā)病到診斷所需時間(就診所需時間)=就診時間-發(fā)病時間

1.2.2診斷正確性 瘧原蟲檢測陽性符合率=省級符合陽性數(shù)/確診病例總數(shù)×100%

瘧原蟲檢測蟲種符合率=省級蟲種符合數(shù)/確診病例總數(shù)×100%

以州市為單位，將報告單位分為衛(wèi)生院、縣醫(yī)院、州醫(yī)院、私立醫(yī)院、縣疾病預防控制中心(CDC)和市CDC，分別比較各州市和不同類型報告單位的采樣及時性和診斷正確性。

1.3統(tǒng)計分析 用Excel 2010建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 19.0分別對率或均數(shù)的差異進行統(tǒng)計分析，檢驗水準0.05。

對影響云南省瘧疾病例實驗室診斷質量的因素進行分析，以各地區(qū)報告單位與省級瘧原蟲檢測蟲種符合率為應變量，就診所需時間、報告單位類型和報告地區(qū)，采用Logistic逐步回歸分析影響因素。

2 結 果

2.1血樣采集及時性、樣本上交覆蓋性指標 除迪慶州外，全省15個州市在2015-2016年均有瘧疾病例報告。血片送樣共968張，濾紙血膜送樣981份，總收樣率為92.15%，其中2016年收樣率為95.9%，較2015年收樣率89.7%上升7%。此外，15個州市除西雙版納和昭通外，其余各州市2016年收樣率均高于2015年；西雙版納和昭通2016年收樣率較2015年分別下降58.7%和16.6%，見圖1。

圖1 2015-2016年不同地區(qū)收樣率Fig.2 Samples collecting rate in different arears in 2015-2016

除迪慶州外，15個州市的網(wǎng)報瘧疾病例在2015-2016年間發(fā)病到診斷所需平均時間為(5.1±6.6)d。其中網(wǎng)報瘧疾病例數(shù)較多的州市，如德宏、保山和昆明，其網(wǎng)報瘧疾病例從發(fā)病到就診所需時間較其他州市要短；而玉溪、曲靖和怒江3個州市的網(wǎng)報病例從發(fā)病到確診需時14 d以上。以報告單位分類，網(wǎng)報病例發(fā)病到鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院就診的時間最短，平均為(3.87±4.14)d，而到縣區(qū)醫(yī)院、州市醫(yī)院和縣區(qū)CDC就診所需的時間則均比到鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院長2～3倍，具有統(tǒng)計學意義。見圖2。

圖2 瘧疾病例發(fā)病到就診所需時間Fig.1 Time from onset to diagnosis spend by malaria patients

2.2 診斷正確性

2.2.1各地區(qū)陽性符合率和蟲種符合率 2015-2016年，省參比實驗室對各州市送檢的所有瘧疾血片和濾紙血膜均完成復核檢測，其中顯微鏡檢瘧疾血片共968例，PCR復核病例981例。不同地區(qū)的診斷正確性結果詳見表1。15個州市中，僅有昆明(χ2=58.06,P<0.05)和臨滄(χ2=41.89,P<0.05)兩地在2016年對病例的診斷陽性結果與省瘧疾參比實驗室鏡檢結果有差異，其他各地與瘧疾診斷參比實驗室的鏡檢或PCR檢測陽性符合率均在95%以上；楚雄和文山則較2015年有所提高。

各州市對蟲種的診斷與省參比實驗室鏡檢或PCR的符合率均無差異，僅臨滄的2016年診斷結果與省參比實驗室PCR診斷相比，蟲種符合率較2015較低(χ2=5.64,P<0.05)，其余州市診斷水平2016年與2015年基本持平，少數(shù)州市曲靖、楚雄和文山有輕微提升。而鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院較其他報告單位對蟲種的區(qū)分診斷較為準確。

結果提示，2015-2016年，全省各州市對瘧疾診斷結果準確性基本持平，邊境地區(qū)診斷水平總體較高。

2.2.22015-2016年瘧疾分蟲種診斷情況 2015、2016年共有10個州市報告未分型瘧疾35例，未分型瘧疾報告最多的州市為德宏(12例)、昆明(5例)和保山及普洱(皆為4例)，其余大理、紅河、麗江、臨滄、曲靖和文山共報告10例。省瘧疾診斷參比實驗室對2015年和2016年的瘧疾網(wǎng)報送樣病例同時進行鏡檢和PCR雙重復核，結果顯示除對三日瘧和卵形瘧二者的檢出結果完全一致外，各級報告單位和省級采用不同方法的檢出結果仍有一定差異性。對蟲種區(qū)分的差異主要表現(xiàn)在省級實驗室較各級報告單位更易檢出惡性瘧和間日瘧的混合感染。

2.3血片制作質量 對云南省除迪慶州外的15各州市2015和2016年分別送檢復核的完整瘧疾血片629和316張進行血片制作質量評價。復檢血片制作總分分別為78.55±8.47和80.34±9.44，2016年血片制作質量較2015年小幅提高。其中德宏州在2015年和2016年的制片平均總分分別為81.19±8.03和84.82±8.43，高于昆明、保山、臨滄和大理等地。同時，德宏州兩年的平均總分也高于昆明、保山、臨滄、大理、版納和普洱等地。結果提示發(fā)病率較高的邊境地區(qū)血片質量制作水平總體高于其他地區(qū)。血片制作質量較低的地區(qū)主要體現(xiàn)在血片涂制時厚薄片布局不合理、厚片未溶血、厚片固定、涂片過厚或過薄、染色過深或過淺，部分地區(qū)血片厚血膜殘缺。見表2。

表1 不同地區(qū)鏡檢與PCR檢測結果符合統(tǒng)計表

Tab.1 Agreement between microscopy and PCR in different areas

地區(qū)檢測樣本數(shù)陽性符合率蟲種符合率鏡檢PCR鏡檢PCR鏡檢PCR2015年2016年2015年2016年2015年2016年2015年2016年2015年2016年2015年2016年德宏27722327922397.898.296.897.897.597.896.497.3昆明26232823100.078.3**88.978.369.260.955.656.5保山186871918797.896.696.896.696.296.695.795.4臨滄2219221995.563.2**95.573.786.457.986.452.6**普洱6969100.0100.0100.0100.083.3100.083.3100.0版納15319393.3100.084.2100.086.7100.078.9100.0大理125125100.0100.083.380.083.340.075.040.0麗江5151100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0怒江6161100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0100.0紅河2424100.0100.0100.0100.050.0100.050.0100.0昭通727285.7100.085.7100.057.150.057.150.0玉溪1212100.0100.0100.0100.0-100.0-100.0曲靖525280.0100.080.0100.060.0100.060.0100.0楚雄535360.0100.060.0100.060.0100.060.0100.0文山363666.7100.066.7100.066.783.366.783.3合計57839059139097.195.195.195.193.192.391.391.3

注：**與2015年比較P<0.05；地區(qū)黑體字體表示邊境州市

表2 不同地區(qū)復檢血片質量表

Tab.2 Quality of blood films in different locations

地區(qū)2015年2016年2015-2016年血片數(shù)總分血片數(shù)總分血片數(shù)總分德宏28181.19±8.0316584.82±8.4344682.53±8.36昆明2670.69±9.35**1675.94±5.6**4272.69±8.45**保山21977.1±8.01**8275.24±8.73**30176.59±8.24**臨滄2775.74±8.93**1272.5±7.66**3974.74±8.6**普洱875±8.72978.11±6.771776.65±7.66**版納1676.31±6.12574±8.222175.76±6.53**大理870.38±9.21**872.75±5.2**1671.56±7.33**麗江779±7.3281.5±3.54979.56±6.54怒江679.83±11.48177779.43±10.53紅河378±1.73475.25±3.86776.43±3.26昭通776.86±4.91276.5±26.16976.78±10.18玉溪279.5±2.12178379±1.73曲靖1276.42±6.161821376.85±6.09楚雄578.6±9.4479.75±3.86979.11±7.08文山284±2.83477.75±6.95679.83±6.4合計62978.55±8.4731680.34±9.44**94579.15±8.84

注：**與德宏州比較，P<0.05； **與2015年比較，P<0.05；地區(qū)黑體字體表示邊境地區(qū)。

2.4省級鏡檢和PCR檢測方法的結果不一致分析 省級參比實驗室同時采用鏡檢和PCR法對968例樣本進行檢測。其中兩種方法結果不一致的樣本有24份，占2.5%(24/968)。不一致性體現(xiàn)在，鏡檢為間日瘧的16份樣本，PCR檢測為陰性，占66.7%(16/24)；鏡檢為陰性的8份樣本，PCR檢測為陽性，占33.3%(8/24)，其中惡性瘧1例和間日瘧6例，惡性瘧和間日瘧混合感染1例。

2.5瘧疾病例實驗室診斷質量的影響因素分析 將除迪慶以外的15個州市按是否位于邊境進行劃分，以鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院為參考，對報告單位類型進行啞變量劃分，對病例復核質量的影響因素進行l(wèi)ogistic回歸分析。自變量為報告單位與省級瘧疾診斷參比實驗室陽性結果的符合率，因變量為自發(fā)病到診斷所需時間、報告單位類型及報告地區(qū)。Logistic逐步回歸分析結果顯示發(fā)病到診斷所需天數(shù)、報告單位類型及報告地區(qū)是否位于邊境地區(qū)都影響瘧疾病例診斷的質量，詳細結果見表3。

表3 瘧疾病例診斷質量的logistic回歸分析

Tab.3 Impact factors of malaria cases diagnosis quality by logistic regression

因變量回歸系數(shù)標準誤wald值P值OR值OR值95%置信區(qū)間診斷所需時間/d-0.0380.0147.4520.0060.9630.940～0.99報告單位類型12.8290.025 縣區(qū)醫(yī)院-0.5020.5920.7190.3960.6050.190～1.93 州市醫(yī)院-1.2330.5515.0140.0250.2910.099～0.86 私立醫(yī)院-0.5660.8290.4660.4950.5680.120～2.88 縣區(qū)CDC-1.0500.5204.0760.0440.3500.130～0.97 州市CDC-1.9770.59611.0060.0010.1380.043～0.45地區(qū)是否邊境-1.0270.3887.0000.0080.3580.170～0.77

3 討 論

云南省是中國瘧疾病例最多的省份，自2012年開始進行網(wǎng)報瘧疾病例的復核工作。為持續(xù)掌握云南省瘧疾病例診斷質量，本文對云南2015-2016年的瘧疾網(wǎng)報病例診斷質量和采樣覆蓋率及及時性進行了分析評價。與董瑩對2012-2014年云南省瘧疾病例診斷質量評價結果相比，全省2015年和2016年的收樣率分別為89.7%和95.9%，低于2014年的水平(96.3%)[5]。在診斷正確性上，2015-2016年各地對網(wǎng)報病例的診斷無論陽性結果或蟲種區(qū)分皆高于2014年水平[5]，并高于我國四川省和廣西賓陽縣水平[8-9]。但與云南省2012-2014年的結果相比[5]，各地區(qū)2016年與省級PCR診斷蟲種符合率為91.35%，略低于2014年水平；臨滄市在定性和定種的正確性上表現(xiàn)不穩(wěn)定，仍有波動，這一結果與董瑩等的調查結果類似。全省對未分型病例的診斷減少18.6%，未分型病例報告最多的州市為德宏(12例)，紅河州則較2012-2014年大幅下降了80%。

此外，省參比實驗室采用顯微鏡檢(χ2=7.67,P<0.05)和PCR(χ2=4.344,P<0.05)兩種方法分別對瘧疾病例進行的復核結果不一致性較2012—2014年上升4.9%和2.1%。省級實驗室和各地區(qū)對相同樣本分別采用傳統(tǒng)鏡檢和nested-PCR法進行病例復核的結果存在一定差異，表現(xiàn)為nested-PCR法較傳統(tǒng)鏡檢更易診斷陽性和區(qū)分蟲種。傳統(tǒng)鏡檢確認瘧疾病原體是瘧疾診斷的金標準，然而受制片質量、原蟲密度、原蟲特征等的影響，使傳統(tǒng)鏡檢的敏感度較nested-PCR較低，即使富有經(jīng)驗的鏡檢專家，也容易導致檢測結果敏感性和特異性的降低[10]，而nested-PCR經(jīng)過多年應用改進，其敏感度和特異度可以達到98%以上[11]，尤其能夠區(qū)別不同蟲種的混合感染。其次，部分地區(qū)采用瘧疾快速診斷法(RDTs)診斷瘧疾，由于RDTs質量參差不齊，對瘧疾和蟲種區(qū)分的限制，加之由于富組氨酸蛋白基因的部分缺失[1]，使報告結果與復核結果存在差異。

Logistic回歸分析提示，各地州對瘧疾病例的診斷與省級PCR診斷蟲種的符合性受發(fā)病到診斷所需天數(shù)、報告單位類型及報告地區(qū)是否為邊境等因素影響。瘧疾病例從發(fā)病到鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院就診的天數(shù)最短，與鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院密集的衛(wèi)生機構布點有關，得益于我國三級預防體系；就診及時保證了適宜的采血時間，提高了檢出率。同時，鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院和各級疾病預防控制機構以及瘧疾發(fā)病率較高的邊境地區(qū)對瘧疾診斷具有較高敏感性，比起其他醫(yī)療機構和其他地區(qū)也更容易準確診斷瘧疾。

自2012年云南省開展網(wǎng)報病例復核工作以來，網(wǎng)報病例各項工作呈現(xiàn)穩(wěn)步上升并維持在一個比較優(yōu)良的健康水平。①由于定期開展對復核工作的評價，逐月向各州市反饋病例復核結果，并輔以點評，各地有目的的針對薄弱環(huán)節(jié)進行整改加強。②為達到2020年全面消除瘧疾的目標，全省各州市重視瘧疾檢出水平的提高，增大鏡檢人員培訓力度。③經(jīng)過2012-2014年對瘧疾病例復核流程、樣本采集及質量控制體系的磨合適應，各州市整體依從性較好，但是仍有少數(shù)地區(qū)仍然需要加強瘧疾綜合防控能力的提高。特別是加強對非邊境地區(qū)各級疾病防治人員的專業(yè)培訓。對其他地區(qū)，尤其是已經(jīng)通過消除瘧疾考核的地區(qū)，應該繼續(xù)加強并保持對瘧疾防治能力的提高。④加強各地各級疾病防治和醫(yī)療單位檢驗人員對瘧疾常見蟲種惡性瘧、間日瘧和惡性瘧混合間日瘧感染的診斷鑒別。三日瘧和卵形瘧雖然不是云南省的主要瘧疾種類，但在2014年的質量評價之后，通過利用省參比實驗室瘧疾鏡檢圖像對各級疾病防控人員對其識別能力進行提高，檢驗人員謹慎認真，反而更易檢出。而省級PCR診斷為間日瘧、惡性瘧或兩者混合感染的病例，基層部門則較易診斷為陰性而漏診。董瑩等[5]調查發(fā)現(xiàn)，基因檢測為間日瘧感染(含混合感染)的血樣以早、晚期滋養(yǎng)體為主，這在鏡檢鑒別上難度增加；加之非洲輸入病例其間日瘧早期滋養(yǎng)體寄生紅細胞存在不顯著脹大、且早期滋養(yǎng)體本身存在胞漿纖細等特征，經(jīng)驗不足鏡檢人員難以做出準確診斷。

總而言之，在消除瘧疾階段，應該研究探討多種形式結合的培訓、實踐方式，持續(xù)提高并保持各地各級疾病防治部門的瘧疾診斷能力。

(致謝：感謝云南省德宏、保山、昆明、普洱、臨滄、大理、怒江、麗江、西雙版納、玉溪、楚雄、紅河、昭通、迪慶、曲靖、文山16個州(市)級及其轄區(qū)各縣疾病預防控制中心的大力支持。)

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