凝膠滲透色譜-高效液相色譜-線性離子阱質(zhì)譜法測定膳食樣品中的氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留

楊 欣， 李 鵬， 苗 虹， 趙云峰， 吳永寧

(1.國家食品安全風(fēng)險評估中心，北京100021;2.衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險評估重點實驗室，北京100021)

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是繼有機磷類農(nóng)藥后發(fā)展較為迅速的一類高效、廣譜殺蟲劑。20世紀(jì)70年代以來，由于有機氯類農(nóng)藥相繼被禁用或者限制使用，以及抗有機磷類農(nóng)藥的昆蟲品種的日益增多，氨基甲酸酯類農(nóng)藥被廣泛應(yīng)用于糧食、蔬菜和水果等各種農(nóng)作物的生產(chǎn)［1］，是中國目前使用量較大的殺蟲劑之一。常見的氨基甲酸酯類農(nóng)藥有涕滅威、克百威、甲萘威、滅多威、殘殺威和滅害威等。

殘留在食品中的各種農(nóng)藥(特別是高毒農(nóng)藥)對人體健康的風(fēng)險評估是許多國家政府機構(gòu)和國際組織用作農(nóng)藥登記評審和農(nóng)藥安全性評價的重要依據(jù)［2，3］。因此，開展農(nóng)藥膳食風(fēng)險評估研究對合理使用農(nóng)藥、保護公眾身體健康和保證食品安全有著非常重要的意義［4，5］。氨基甲酸酯類農(nóng)藥降解產(chǎn)物通常具有與母體化合物相同甚至更強的活性。比如，涕滅威亞砜具有比涕滅威和涕滅威砜更強的膽堿酯酶抑制作用，因此，世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織/農(nóng)藥殘留聯(lián)席會議(World Health Organization/Food and Agriculture Organization/Joint Meeting on Pesticide Residues，WHO/FAO/JMPR)規(guī)定檢測和評估某些農(nóng)藥時需同時考慮降解產(chǎn)物的活性影響［6］。例如，在評估涕滅威時，定義涕滅威為涕滅威及其砜、亞砜之和，以涕滅威表示;克百威為克百威和3-羥基克百威之和，以克百威表示，等等。

膳食樣品不同于一般食物樣品，是經(jīng)烹調(diào)、加工、聚類、混合制備成的樣品，因此樣品不僅油脂含量高，基質(zhì)更復(fù)雜，而且樣品經(jīng)聚類后混合相當(dāng)于被進一步稀釋，其中的污染物含量很低，對樣品的前處理和檢測方法的靈敏度和準(zhǔn)確度要求更高。目前文獻報道的氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析方法主要有:氣相色譜法［7］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［8］、液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［9－12］、酶聯(lián)免疫法［13］，樣品基質(zhì)有尿液［9］、水［10，11］、水果［12］、蔬菜［13］和茶葉［14］等。

離子阱質(zhì)譜在一次進樣過程中可以得到二級和三級子離子的全掃描質(zhì)譜圖，因此在對目標(biāo)物做定性確證分析時，獲得的化合物結(jié)構(gòu)信息比四極桿質(zhì)譜多。同時，利用三級子離子定量可以提高信噪比，降低復(fù)雜基質(zhì)的干擾。為評估中國人群氨基甲酸酯類農(nóng)藥膳食暴露，我們以JMPR農(nóng)藥殘留暴露評估需同時監(jiān)測農(nóng)藥母體和降解產(chǎn)物的規(guī)定為依據(jù)，按照中國總膳食研究(Chinese TDS)食物樣品分類原則［15］，挑選基質(zhì)較為復(fù)雜的蔬菜類和肉類樣品為樣品研究基質(zhì)，利用線性離子阱三級質(zhì)譜靈敏度高、特異性強，能有效排除基質(zhì)干擾的特點，建立了同時測定多種氨基甲酸酯類農(nóng)藥及其降解產(chǎn)物(涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、甲奈威、克百威、3-羥基克百威、丁硫克百威、滅多威、硫雙滅多威、甲硫威、殘殺威、滅害威、乙硫苯威、乙硫苯威砜、乙硫苯威亞砜)的高效液相色譜-串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜法(HPLCLIT-MS3)。該方法靈敏、準(zhǔn)確，能夠滿足氨基甲酸酯類農(nóng)藥膳食評估的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LTQ液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo Fisher Scientific公司):配有電噴霧離子源(ESI)及Xcalibur 2.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);AccuPrep MPSTM凝膠滲透色譜儀(美國J2 Scientific公司);Sigma3K-15離心機(美國Sigma公司):配有12156型轉(zhuǎn)子;Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)。甲醇、乙腈和丙酮為色譜純(美國Fisher公司);環(huán)己烷、乙酸乙酯為色譜純(美國J.T.Baker公司);甲酸、甲酸銨為色譜純(美國Tedia公司);實驗用水為經(jīng)Milli-Q超純水器過濾的超純水。

標(biāo)準(zhǔn)品:涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、甲奈威、克百威、3-羥基克百威、丁硫克百威、滅多威、硫雙滅多威、甲硫威、殘殺威、滅害威、乙硫苯威、乙硫苯威砜、乙硫苯威亞砜(純度均≥96.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司);內(nèi)標(biāo):13C6-克百威(100 mg/L，純度≥99%，美國 Cambridge Isotope Lab，Inc.)。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別稱取10.0 mg(精確到0.01 mg)氨基甲酸酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于－20℃冰箱中保存。根據(jù)實際需要分別取適量的單標(biāo)準(zhǔn)儲備液用乙腈稀釋混合后配制成混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液用初始流動相配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:準(zhǔn)確移取1.0 mL13C6-克百威標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/L)于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成10 mg/L的內(nèi)標(biāo)儲備液，于－20℃冰箱中保存。使用前用乙腈逐級稀釋為1.0 mg/L的同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液。

1.2 樣品前處理

1.2.1 樣品提取

稱取試樣2.0 g(精確至0.01g)于50 mL具塞聚丙烯離心管中，加入20 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液渦旋振蕩30 s混勻，加入 1 g NaCl、4 g MgSO4，混勻后加入20 mL乙腈(經(jīng)正己烷飽和)，渦旋振蕩30 s混勻后，于20℃超聲提取30 min，在6 000 r/min離心5 min;上清液(乙腈層)轉(zhuǎn)移至另一個50 mL具塞聚丙烯離心管中，樣品管中加入20 mL乙腈(經(jīng)正己烷飽和)再次超聲提取10 min，于6 000 r/min下離心5 min后，轉(zhuǎn)移乙腈層，與第一次的上清液合并。提取液經(jīng)裝有5 g無水硫酸鈉的玻璃漏斗，濾紙過濾至150 mL雞心瓶中，用20 mL乙腈分兩次淋洗無水硫酸鈉并收集濾液。樣品提取液在35℃水浴中經(jīng)旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，余下的溶劑用弱氮氣流緩慢吹干。用適量環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1，v/v)溶解殘渣，并清洗雞心瓶后轉(zhuǎn)移至10 mL刻度離心管中，用環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1，v/v)定容至刻度，于6 000 r/min下離心10 min，上層清液經(jīng)0.22 μm 有機相微孔濾膜過濾于10 mL凝膠滲透色譜(GPC)專用試管中，待GPC凈化。

1.2.2 樣品凈化

采用GPC進行凈化，GPC凈化柱管尺寸為300 mm×20 mm，內(nèi)裝25 g Bio-Beads S-X3填料(美國Bio-Rad公司);紫外檢測波長為254 nm;流動相為環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1，v/v);流速為 4.7 mL/min;進樣量為5 mL。從10 min開始收集，收集時間為10 min。將收集液于35℃水浴中濃縮至近干，余下溶劑用弱氮氣流緩慢吹干后用200 μL初始流動相溶解，經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾于LC專用進樣瓶中，待HPLC-LIT-MS分析。

1.3 液相色譜-質(zhì)譜條件

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱:SHISEIDO Capcell PAK CR柱(100 mm ×2.1 mm，5 μm;SCX-C18(1∶4));柱溫:35℃;流動相:A液為含有5 mmol/L甲酸銨和0.1%(v/v)甲酸的水溶液，B液為乙腈;梯度洗脫條件:0～15 min，10%B ～70%B;15～20 min，70%B ～90%B;20～24.5 min，90%B;24.5～25 min，90%B～10%B;25～30 min，10%B;樣品池溫度:4℃;進樣量:10 μL;流速:0.2 mL/min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離正離子源(ESI+);噴霧電壓4 kV;毛細(xì)管電壓72 V;棱鏡電壓36 V;毛細(xì)管溫度300℃;鞘氣流速7 mL/min;輔助氣流速15 mL/min;掃描方式:三級質(zhì)譜選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM);保留時間及質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氨基甲酸酯類農(nóng)藥保留時間和主要質(zhì)譜參數(shù)Table 1 R etention times and main MS parameters of NMC pesticides

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

為考察在本實驗條件下涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、甲奈威、克百威、3-羥基克百威、丁硫克百威、滅多威、硫雙滅多威、甲硫威、殘殺威、滅害威、乙硫苯威、乙硫苯威砜、乙硫苯威亞砜及內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜行為，根據(jù)目標(biāo)物的相對分子質(zhì)量，在m/z 50～500范圍內(nèi)，分別用500 μg/L的單標(biāo)準(zhǔn)工作液進行流動注射分析，采用ESI源正離子掃描，先優(yōu)化電噴霧電壓、鞘氣、輔助氣，然后逐級優(yōu)化各化合物的質(zhì)譜參數(shù)，確定特征碎片離子及碰撞能量等質(zhì)譜分析條件。結(jié)果見表1。

大多數(shù)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的母體和降解產(chǎn)物在普通 C18柱上都有保留［9，12］，但在本實驗條件下多數(shù)氨基甲酸酯農(nóng)藥降解產(chǎn)物的色譜峰拖尾，峰形較差。SHISEIDO Capcell PAK CR是一款由反相填料C18和強陽離子(磺酸基團)填料混合填充而成的色譜柱，具有C18柱反相分離模式和磺酸基的強陽離子交換模式，因此在酸性條件下，有利于弱堿性化合物的保留及色譜峰形的改善。在已有工作［16］的基礎(chǔ)上，我們考察了所有目標(biāo)物在 SHISEIDO Capcell PAK CR 柱(100 mm ×2.1 mm，5 μm;SCX-C18(1∶4))上的色譜行為，結(jié)果表明，降解產(chǎn)物在CAPCELL PAK CR柱上的峰形優(yōu)于在普通C18柱上的峰形，因此選用CAPCELL PAK CR色譜柱為分析柱。

2.2 提取和凈化條件的選擇

乙腈是提取氨基甲酸酯類農(nóng)藥的常用試劑，由于膳食樣品和花生同屬油脂含量高的樣品，因此本實驗參照已建立的花生樣品的提取凈化方法［16］，用正己烷飽和后的乙腈作為提取溶劑，GPC凈化去除樣品中油脂和色素等大分子基質(zhì)的干擾。GPC凈化條件以油脂含量最高的肉類樣品為研究對象，從9.5 min開始收集餾分，但發(fā)現(xiàn)餾分蒸干后仍有少量油脂。改為從10 min開始收集，餾分中基本沒有油脂殘留。因此確定所有樣品基質(zhì)都從10 min開始收集GPC餾分，收集時間為10 min。從回收率結(jié)果看，選定的GPC實驗條件能夠保證在有效凈化樣品的前提下收集大部分目標(biāo)物。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)可以用基質(zhì)效應(yīng)因子(matrix factor，MF)來表示，MF=A/B×100%。A為目標(biāo)物在純?nèi)軇┲械捻憫?yīng)值，B為在空白樣品基質(zhì)(蔬菜類)中添加相同水平目標(biāo)物的響應(yīng)值，實驗結(jié)果見表2。

表2 氨基甲酸酯類農(nóng)藥在蔬菜類樣品中的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effect of NMC pesticides in the vegetable samples

一般而言，MF＞150%為基質(zhì)抑制，MF ＜70%為基質(zhì)增強。表2結(jié)果表明，基質(zhì)效應(yīng)對降解產(chǎn)物的影響比較大，其中對涕滅威砜、涕滅威亞砜有基質(zhì)增強作用，對3-羥基克百威、乙硫苯威砜和乙硫苯威亞砜有基質(zhì)抑制作用，對農(nóng)藥母體的影響相對較小。由于同一目標(biāo)物在不同基質(zhì)中所受的基質(zhì)效應(yīng)的大小不同，為降低基質(zhì)效應(yīng)對目標(biāo)物的影響，應(yīng)使用相應(yīng)的空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 定性依據(jù)及定量方法

本文采納歐盟2002/657/EC［17］規(guī)定的質(zhì)譜定性確證要求，即采用低分辨質(zhì)譜進行定性確證分析時需要4分(每個母離子1分，每個子離子1.5分，總共4分);進行實際樣品測定時，如果樣品質(zhì)量色譜峰的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液的目標(biāo)組分的保留時間一致(變化范圍在±2.5%之內(nèi))，而且質(zhì)量色譜峰的離子相對豐度比與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子相對豐度比偏差在±20%之間，則可判定樣品中存在目標(biāo)化合物。每個目標(biāo)物均以13C6-克百威為內(nèi)標(biāo)物，采用內(nèi)標(biāo)法定量。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率、精密度和檢出限

在選定的實驗條件下，采用空白蔬菜類和肉類樣品進行加標(biāo)回收試驗，分別做低、中、高3個加標(biāo)水平，每個濃度水平平行做5份樣品，計算平均加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。各目標(biāo)物平均加標(biāo)回收率在60.4%～114%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.46%～16.2%之間，結(jié)果見表3。以平均加標(biāo)回收率表示方法的準(zhǔn)確度，以平均加標(biāo)回收率的RSD表示方法的精密度。盡管個別化合物(滅害威)或代謝產(chǎn)物(3-羥基克百威)的回收率偏低(60.4%)，但從加標(biāo)回收實驗結(jié)果看，總體來說該方法的準(zhǔn)確度及精密度符合多殘留分析的要求。各目標(biāo)物在空白蔬菜類樣品基質(zhì)中的質(zhì)量色譜圖見圖1。

用混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，以空白基質(zhì)為稀釋液配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(內(nèi)標(biāo)濃度均為100 μg/L)。以各組分定量離子色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)物色譜峰面積之比乘以內(nèi)標(biāo)的濃度為縱坐標(biāo)，以各目標(biāo)組分的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各組分線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.991 6，結(jié)果見表4。

用蔬菜類樣品低加標(biāo)水平計算各組分的檢出限(LOD)和定量限(LOQ):S/N=3對應(yīng)的含量為LOD，S/N=10對應(yīng)的含量為LOQ。各組分在蔬菜類樣品中的檢出限在0.001～0.010 mg/kg范圍內(nèi)。結(jié)果見表4。

圖1 空白蔬菜類樣品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥加標(biāo)(20 μg/kg)的質(zhì)量色譜圖Fig.1 SR M chromatograms of NMC pesticides in blank vegetable samples(spiked level of 20 μg/kg)

表3 蔬菜類和肉類樣品中氨基甲酸酯類農(nóng)藥的加標(biāo)回收率及精密度(n=5)Table 3 R ecoveries and R SDs of NMC pesticides in blank meat and meat products/vegetable and vegetable products(n=5)

2.6 實際樣品測定

應(yīng)用所建立的方法對2007年第四次中國總膳食研究項目的9類樣品基質(zhì)(肉類、蛋類、乳類、水果類、蔬菜類、谷類、豆類、薯類、水產(chǎn)類)共108份樣品中的氨基甲酸酯類農(nóng)藥進行了檢測，結(jié)果如下:檢出了涕滅威和克百威，檢出率分別為5.6%和8.3%，且其在蔬菜類樣品中的含量較高，涕滅威的最高含量為105 μg/kg，克百威的最高含量為3.56 μg/kg(見圖2);未檢出本文所考察的其他氨基甲酸酯類農(nóng)藥。

表4 氨基甲酸酯類農(nóng)藥的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 4 Linear ranges，correlation coefficients，LODs and LOQs of NMC pesticides

圖2 蔬菜類樣品中檢出的克百威的(a)質(zhì)量色譜圖及(b)三級質(zhì)譜圖Fig.2 (a)MR M chromatogram and(b)MS3spectrum of carbofuran in a real vegetable sample

3 結(jié)論

本文以膳食樣品為研究對象，建立了高效液相色譜-串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜法(HPLC-LIT-MS)測定氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測方法，為氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留監(jiān)控和風(fēng)險評估等研究提供了一種準(zhǔn)確、可靠的分析手段。

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