廣西漢族人群高血壓與瞬時受體電位香草酸亞型1基因多態(tài)性/單倍型相關(guān)性病例對照研究

藍子深，何東明，陸永光，唐真武

(廣西欽州市第二人民醫(yī)院心內(nèi)科，廣西 欽州 535000)

心血管疾病是對人類健康威脅最嚴重的疾病之一，在全球死因順位中位居第一[1]。高血壓是心腦血管病主要的危險因素，當前我國高血壓的患病率和絕對死亡數(shù)也在快速增長[2]，廣西城鄉(xiāng)居民高血壓患病率也處于快速增長期[3]。高血壓受遺傳、環(huán)境共同影響而致，不同民族高血壓患病率及危險因素不盡相同[4]。研究高血壓人群遺傳機制，對精準防控和個性化治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

病例組為欽州市第二人民醫(yī)院心血管內(nèi)科住院及門診的漢族高血壓病患者；對照組為同院體檢科性別相同、年齡±5歲以內(nèi)的漢族成年健康體檢者。所有的研究對象均為廣西漢族人群，經(jīng)倫理委員會批準，簽署知情同意書。

高血壓病診斷根據(jù)1999年WHO高血壓診斷標準，即收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg。排除繼發(fā)性高血壓、冠心病、糖尿病、心肌病、心臟瓣膜疾病、先天性心臟病、甲亢、炎癥、風(fēng)濕免疫病、腫瘤、嚴重肝腎功能損害及過度飲酒、服避孕藥史。年齡>18歲。

1.2 實驗室檢測方法

使用成品化試劑盒，提取血樣、組織、細胞、唾液中的DNA。使用NanoDrop2000儀器進行OD值檢測，1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA質(zhì)檢合格，轉(zhuǎn)移至96孔板，置于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)NCBI上查找的瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential family vanilloid subtype 1，TRPV1)基因rs222747C/G、rs224534A/G、rs4790522A/C及rs8065080 C/T序列，選擇包含位點的序列并輸入Sequenom公司的引物設(shè)計軟件Assay design3.1設(shè)計PCR反應(yīng)和單堿基擴展引物合成。

取1.5 mL EP管中配置PCR master mix ，振蕩低速離心。每個加樣孔中加入4 μL PCR master mix，最后加入1 μL模板DNA(20 ng/μL)混勻，啟動PCR 擴增反應(yīng)程序。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用蝦堿性磷酸酶 (shrimp alkaline phosphatase,SAP)處理，以去除體系中游離的dNTPs。在新1.5 mL EP管中配制堿性磷酸酶處理反應(yīng)液，在堿性磷酸酶處理結(jié)束后，進行單堿基延伸反應(yīng)。采用MassARRAYNanodispenser RS1000點樣儀，將樹脂純化后的延伸產(chǎn)物移至384-well SpectroCHIPbioarray上，使用MALDI-TOF質(zhì)譜儀分析，檢測結(jié)果使用TYPER 4.0軟件獲取原始數(shù)據(jù)及基因分型圖，并檢查數(shù)據(jù)文件的完整性和正確性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

根據(jù)測序的結(jié)果直接計算出基因型和等位基因的頻率；通過SHEsisPL在線平臺(http://shesisplus.bio-x.cn/SHEsis.html)進行Hardy-einberg(H-W)平衡檢驗，對符合H-W平衡的位點進行單倍型分析。一般情況比較采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗、計量資料采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

本調(diào)查共納入病例組177例，對照組207例。兩組男性所占比例分別為49.15%(87/177)和(51.21)106/207，年齡分別為(33.56±9.81)歲和(35.13±8.32)歲，兩組間性別和年齡分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組人群TRPV1基因的rs17706630、rs222747、rs222749、rs224534、rs4790522 、rs8065080等6個位點基因型頻率符合 Hardy-Weinberg平衡。對照組rs4790521位點基因型頻率不符合Hardy-Weinberg平衡，兩組rs9894618位點基因型均為CC，這兩個位點未納入進一步分析。

2.2 TRPV1基因6個SNP位點多態(tài)性分布

rs8065080位點T等位基因頻率病例組高于對照組，兩組基因型頻率分布相當。兩組人群TRPV1基因的rs17706630、rs222747、rs222749、rs224534、rs4790522等5個位點基因型頻率和等位基因頻率差別無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1和表2。

2.3 TRPV1基因6個SNP 位點組成的單倍型頻率分布

經(jīng)SHEsisPL在線平臺分析，6個SNP位點多態(tài)性構(gòu)成頻率>0.03的單倍型共有7種，分別為：GCGACC、GGAAAT、AGGGCT、AGGGCC、GCGACT、AGGGAT和GGAACC。7種單倍型在兩組間分布差別均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

3 討論

高血壓已成為危害人們健康的主要慢性病之一，是多種慢性疾病的危險因素[5-6]，對人類健康造成重大威脅，一旦發(fā)病需要終生治療。高血壓影響因素復(fù)雜，既包括性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、家庭人均收入、文化程度、吸煙情況，也受遺傳因素影響[7]。TRPV1，又稱辣椒素受體(vanilloid receptor subtype1，VR1)，屬于瞬時感受器電位家族成員之一，是一個非選擇性配體門控陽離子通道[8]。TRPV1 可被辣椒素、多種內(nèi)源性配體及酸、熱等刺激因素激活,釋放多種神經(jīng)活性肽,進而參與痛覺整合、心血管系統(tǒng)調(diào)節(jié)、抗炎、調(diào)節(jié)胃腸功能、抗腫瘤等生理和病理生理過程[9]。TRPV1 基因位于人類 17p13 染色體，多個位點存在非同義單核苷酸多態(tài)性[10]。目前國內(nèi)外已有研究證實，TRPV1基因多態(tài)性與多種疾病密切相關(guān),且基因多態(tài)性在不同民族間存在差異[11]。rs222747、rs4790522位點的多態(tài)性與兒童哮喘和特異性咳嗽相關(guān)[11-12]；rs224534與痛覺相關(guān)[13]；rs8065080位點的多態(tài)性可能影響個體對腸易激綜合癥的遺傳易感性[14]，并與膝關(guān)節(jié)炎相關(guān)[15]。

動物實驗表明，TRPV1 能減輕高鹽攝入誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，減少超氧陰離子產(chǎn)生，提高 NO 的生物利用度，從而改善高鹽膳食導(dǎo)致的阻力血管的內(nèi)皮依賴性舒張功能的損害，預(yù)防高鹽攝入導(dǎo)致的高血壓[16]。也有研究認為，TRPV1 通道能夠通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣濃度、血管平滑肌增殖遷移及神經(jīng)遞質(zhì)釋放等來調(diào)節(jié)高血壓等疾病，可能是預(yù)防高血壓發(fā)生發(fā)展的一個有效靶點[17]。

表1高血壓組和對照組6個SNP位點等位基因頻率分布[n(%)]

SNP病例組對照組P值OR值rs177066300.6951.083(0.726～1.615)G300(84.7)355(85.7)A54(15.3)59(14.3)rs2227470.1151.258(0.944～1.677)G161(45.4)165(39.8)C193(54.6)249(60.2)rs2227490.1331.284(0.925～1.783)G257(72.5)320(77.2)A97(27.5)94(22.8)rs2245340.4731.133(0.805～1.594)G82(23.1)87(21.1)A272(76.9)327(78.9)rs47905220.81.04(0.764～1.416)C245(69.2)290(70.1)A109(30.8)124(29.9)rs80650800.0471.335(1.003～1.779)C186(52.6)247(59.7)T168(47.4)167(40.3)

表2高血壓組和對照組6個SNP位點等位基因頻率分布[n(%)]

SNP病例組對照組P值rs177066300.615GA50(28.2)51(24.6)AA2(11.2)4(19.1)GG125(70.6)152(73.4)rs2227470.239GC97(54.8)105(50.7)CC48(27.1)72(34.8)GG32(18.1)30(14.5)rs2227490.102GG92(51.8)118(57.1)GA73(41.2)84(40.5)AA12(7.0)5(2.4)rs2245340.515GA66(37.3)77(37.2)AA103(58.2)125(60.4)GG8(4.5)5(2.4)rs47905220.643CC86(48.6)99(47.9)AC73(41.3)92(44.4)AA18(10.1)16(7.7)rs80650800.127CT88(49.9)103(49.9)TT40(22.5)32(15.4)CC49(27.6)72(34.7)

表3 TRPV1基因6個SNP 位點組成的單倍型頻率分布比較[n(%)]

單倍型SNP1770663022274722274922453447905228065080病例組對照組P值OR值ⅠGCGACC131(37)174(42)0.1560.810(0.605～1.083)ⅡGGAAAT 69(19.4) 60(14.4)0.0641.428(0.977～2.087)ⅢAGGGCT27(7.6)28(6.7)0.6431.138(0.657～1.970)ⅣAGGGCC16(4.5)13(3.1)0.3171.460(0.692～3.078)ⅤGCGACT16(4.5)12(2.8)0.2321.585(0.739～3.398)ⅥAGGGAT10(2.8)14(3.3)0.6580.830(0.364～1.893)ⅦGGAACC 9(2.5)16(3.8)0.3030.648(0.283～1.487)

本研究未能發(fā)現(xiàn)廣西漢族人群TRPV1基因8個位點(rs17706630、rs222747、rs222749、rs224534、rs4790521、rs4790522、rs8065080、rs9894618)基因型、單倍型與高血壓關(guān)聯(lián)，但部分單倍型(如GGAAAT)可能是高血壓危險因素。下一步我們將增大樣本量，并結(jié)合環(huán)境因素進行分析，以進一步明確TRPV1基因多態(tài)性/單倍型與廣西漢族人群高血壓關(guān)聯(lián)，為防治高血壓提供更準確依據(jù)。

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