尿路上皮細胞在老年SD大鼠前列腺導管內(nèi)的表達情況

雷琳，安凌悅，羅光恒，孫兆林，郝佳

(1.貴州醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院；2.貴州省人民醫(yī)院；3.貴州省建設(shè)職業(yè)技術(shù)學院，貴州 貴陽 550002)

良性前列腺增生是老年男性的常見疾病，前列腺切除術(shù)是治療進展期良性前列腺增生的有效方式。前列腺切除術(shù)后創(chuàng)面最終修復機制及修復源細胞研究尚不明確。1996年P(guān)ow-Sang等[1]認為前列腺切除術(shù)后修復前列腺部尿道的細胞主要源于膀胱頸的尿路上皮細胞爬行覆蓋創(chuàng)面，完成修復過程，這個觀點被大多數(shù)泌尿外科醫(yī)生所認可。同年，Eduardo等[2]提出不同意見，認為修復前列腺部尿道的尿路上皮細胞主要來源于殘余的前列腺上皮細胞或?qū)Ч軆?nèi)皮細胞的觀點，但其具體修復機制并未進一步深入研究。2012年Son等[3]在研究前列腺癌時發(fā)現(xiàn)前列腺導管內(nèi)存在CK7陽性尿路上皮細胞。2016年作者發(fā)現(xiàn)，前列腺切除術(shù)后前列腺部尿道的修復細胞來源于膀胱頸的可能性較小，來源于殘余前列腺部細胞的可能性大[4-5]，該細胞可能是殘余前列腺導管內(nèi)的尿路上皮細胞。正常前列腺導管腔面雖然覆蓋腺上皮，但正常前列腺導管內(nèi)是否存在尿路上皮細胞目前尚未見報道。本研究的目的旨在探索老年SD大鼠前列腺導管內(nèi)是否存在尿路上皮細胞及其形態(tài)特點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

老年雄性SD大鼠15只，購于貴州醫(yī)科大學動物房(合格證號：SCXK,黔 2012-0004)，年齡1.5歲，體重600～700 g。

1.2 HE染色和免疫組化染色

取5只老年雄性SD大鼠，水合氯醛(0.5 mL/100 g)麻醉，麻醉生效后仰臥位固定，常規(guī)消毒后行下腹部正中切口至恥骨聯(lián)合，切開腹壁全層，充分暴露盆腔臟器，仔細解剖膀胱、前列腺及尿道，將三者完整取出，用福爾馬林固定。將組織脫水、石蠟固定后連續(xù)切片行HE染色，同時采用免疫組化EnVision兩步法對CK7、CK20及UroplakinⅢ(UPⅢ)進行染色。染色步驟按照說明書進行操作，一抗CK7、CK20及UPⅢ的工作濃度分別是1:100、1:200和1:200，用已知陽性的人膀胱、前列腺及尿道組織作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.3 流式細胞學檢測

另10只老年雄性SD大鼠，隨機分成實驗組和空白對照組，每組5只老年雄性SD大鼠。水合氯醛(0.5 mL/100 g)麻醉，麻醉生效后仰臥位固定，常規(guī)消毒后行下腹部正中切口至恥骨聯(lián)合，切開腹壁全層，充分暴露盆腔臟器，仔細解剖膀胱、前列腺側(cè)葉及前列腺腹側(cè)葉，將三者完整取出，碎冰保存。將上述3種組織PBS清洗，制備單細胞懸液，前列腺組織用胰蛋白酶37 ℃消化45 min(1 g組織加入10 mL胰酶)，膀胱組織在相同理化條件下加用0.1%膠原酶消化45 min，每5～10 min震蕩1次。冷卻懸液后過濾篩除去多余組織，調(diào)整細胞數(shù)量為1×106個/mL，離心后PBS重懸細胞，加入冷PBA(100 Ml PBS加入2 mL胎牛血清)再次離心，棄上清，結(jié)合一抗(UPⅢ)冰上孵育30 min。再次冷PBA離心洗滌1次，去除多余未結(jié)合抗體，結(jié)合二抗(FITC)冰上孵育30 min，冷PBA離心、洗滌后PBS重懸細胞避光，以UPⅢ染色陽性的尿路上皮細胞設(shè)門，流式細胞技術(shù)檢測三種不同組織內(nèi)UPⅢ的表達情況，以PBS代替二抗作空白對照，觀察前列腺導管內(nèi)是否存在尿路上皮細胞。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS24.0軟件進行統(tǒng)計學處理，分析膀胱、前列腺腹側(cè)葉和前列腺側(cè)葉流式細胞學樣本五組數(shù)據(jù)熒光強度是否有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計方法為t檢驗，以P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

HE染色可見膀胱組織和前列腺部尿道組織內(nèi)典型尿路上皮有三層細胞，分別為傘狀細胞層、中間細胞層以及基底細胞層。前列腺部尿道中尿路上皮的傘狀細胞層細胞呈極性排列，細胞核體積大于中間細胞層和基底細胞層，?？梢婋p核；中間細胞層和基底細胞層均呈極性排列，三層細胞胞質(zhì)均勻(圖1A、B)。

前列腺導管開口處也可見尿路上皮，厚薄不均，約2～3層，傘狀細胞層僅在前列腺導管開口黏膜褶皺處可見。該處尿路上皮的傘狀細胞未呈極性排列，體積與前列腺部尿道中尿路上皮的傘狀細胞無明顯差異。前列腺導管開口處尿路上皮表面的傘狀細胞細胞核常居中，偶見雙核，胞核體積大小與前列腺部尿道內(nèi)尿路上皮的傘狀細胞無明顯差異。前列腺導管開口處尿路上皮的中間細胞層和基底細胞層完整，細胞呈極性排列。隨著前列腺導管向管腔底部延伸，該處尿路上皮中的傘狀細胞層、中間細胞層和基底細胞層的細胞數(shù)量逐漸減少，細胞排列由極性轉(zhuǎn)變?yōu)榉菢O性，直至轉(zhuǎn)化為單層極性排列的腺上皮細胞(圖1C、D)。

2.2 免疫組化結(jié)果

膀胱組織和尿道組織內(nèi)尿路上皮細胞，CK7和UPⅢ強陽性，CK20部分細胞弱陽性，均在細胞漿表達；前列腺導管開口處存在CK7和UPⅢ中度陽性，CK20陰性的細胞，均在細胞漿表達；隨著前列腺導管延伸至管腔底部，該細胞CK7和UPⅢ的表達逐漸減弱，直至最后不表達，但該細胞的免疫組化表達程度較膀胱尿路上皮細胞低(圖1E～P)。

熒光強度表達情況膀胱組織前列腺側(cè)葉組織前列腺腹側(cè)葉組織實驗組(n=5)2452.00±491.622844.20±139.553647.60±342.10對照組(n=5)494.80±40.58219.00±24.37610.60±50.86統(tǒng)計值-8.87-41.44-19.64P值<0.001<0.001<0.001

2.3 流式細胞檢測結(jié)果

膀胱組織、前列腺側(cè)葉組織及前列腺腹側(cè)葉組織流式細胞結(jié)果顯示，實驗組3種組織的FITC熒光強度均較空白對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。(表1及圖2)前列腺側(cè)葉和腹側(cè)葉組織內(nèi)均存在UPⅢ陽性的細胞(圖3)。該UPⅢ陽性的細胞在膀胱組織中分別占比為(14.3±3.5)%，在前列腺側(cè)葉組織中占比為(50.76±3.99)%，在前列腺腹側(cè)葉中占比為(55.96±3.85)%(表2)。

不同組織內(nèi)UPⅢ陽性細胞的占比情況膀胱組織前列腺側(cè)葉組織前列腺腹側(cè)葉組織實驗組(n=5)14.3±3.550.76±3.9955.96±3.85對照組(n=5)2.96±0.590.76±0.3057.76±0.96

3 討論

本次研究所選SD大鼠，平均壽命為2年，日齡1年以上的即可稱之為老齡SD大鼠，日齡1.5年的雄性SD大鼠即可相當于人50周歲以上的男性。因此選用日齡1.5年的老年雄性SD大鼠可以模擬鼠前列腺增生模型。

尿路上皮細胞最常分布在腎盂、輸尿管、膀胱和前列腺部尿道。正常尿路上皮由三層細胞組成，分別為基底細胞、中間細胞以及最上層的傘狀細胞，傘狀細胞的表面存在增加細胞表面張力、影響細菌黏附和流體運輸?shù)奈⒔q毛結(jié)構(gòu)，能夠維持泌尿道的屏障功能，保持尿液在泌尿道內(nèi)正常的貯存和流動[6-7]。

前列腺部尿道腔內(nèi)表面被尿路上皮覆蓋，前列腺導管開口于前列腺部尿道，以保持前列腺液通過前列腺導管排入前列腺部尿道。1990年Lee等[8-9]研究SD大鼠前列腺導管時發(fā)現(xiàn)，前列腺導管的內(nèi)層上皮細胞因為其形態(tài)不同可以分為三個不同的區(qū)域，遠端(前列腺導管底部)和中間段均可見高柱狀細胞，近端(前列腺導管近尿道部)腔面被上皮細胞覆蓋，但其并未指明三個區(qū)域的細胞是否存在尿路上皮細胞或者具有尿路上皮細胞功能的細胞。

前列腺導管內(nèi)襯有前列腺上皮，前列腺上皮主要由腺泡和導管上皮構(gòu)成，腺泡和導管上皮含有分泌細胞、基底細胞和散在的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞。前列腺基底細胞具有很強的增生、修復能力，同時也具有向腺上皮和尿路上皮分化的能力[10]；此外，它還可能存在維持前列腺發(fā)育、成熟和功能的具有分化潛能的干細胞[11]。作者的前期研究推測前列腺切除術(shù)后前列腺部尿道的修復細胞可能來源于前列腺基底細胞，雖然有文獻報道前列腺特異抗原(PSA)、聚集素(cd133)、核蛋白(P63)和前列腺干細胞抗原(PSCA)等有功能的特異性抗體[12-15]，但由于作者無法選擇合適的干細胞標記物進行前列腺干細胞的篩選，而前列腺基底細胞篩選、培養(yǎng)和傳代極其困難，因此未能完成進一步實驗。

人尿液中含有尿路上皮細胞，該細胞可能是前列腺切除術(shù)后創(chuàng)面的修復的細胞來源。在完成犬經(jīng)膀胱前列腺切除術(shù)+雙側(cè)輸尿管皮膚造瘺+膀胱造瘺術(shù)的實驗后，作者觀察到在無尿液刺激的情況下，前列腺切除術(shù)后創(chuàng)面仍能完成修復，因此尿液中的種子細胞作為創(chuàng)面再上皮化的來源較小[16]。有趣的是尿液中的一些細胞生長因子(如EGF、TGF)，有可能為前列腺切除術(shù)后創(chuàng)面的修復起到了促進的作用，而這也將成為我們下一步的研究方向。

要揭示前列腺切除術(shù)后創(chuàng)面的修復機制，首先要找到創(chuàng)面修復的源細胞，即要證實前列腺導管內(nèi)是否存在尿路上皮細胞或者具有尿路上皮細胞功能細胞的可能。本研究從HE染色切片上可以觀察到老年SD大鼠前列腺導管開口處存在形態(tài)和大小與前列腺部尿道內(nèi)尿路上皮細胞相似的尿路上皮，但SD大鼠前列腺導管開口處尿路上皮厚薄不均，表面?zhèn)銧罴毎麑游闯蕵O性排列，隨著前列腺導管延伸至管腔底部，尿路上皮典型的三層細胞結(jié)構(gòu)消失，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂屑毎麡O性、單層排列的腺上皮細胞。前列腺部尿道和膀胱內(nèi)尿路上皮中傘狀細胞的主要功能為輸送尿液和防止尿液及細菌等物質(zhì)滲入肌層，前列腺導管是為了儲存和輸送前列腺液而存在。適應是生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理機能與其賴以生存的一定環(huán)境條件相適應的現(xiàn)象，因此前列腺導管內(nèi)尿路上皮結(jié)構(gòu)不如前列腺部尿道和膀胱尿路上皮典型；但由于前列腺導管開口于前列腺部尿道，導管開口處仍能接觸到部分尿液，該處尿路上皮仍可見到數(shù)量較少的典型三層細胞結(jié)構(gòu)。

CK7存在于尿路上皮細胞和一些導管上皮、間皮、假復層上皮中[17]，CK20的表達在正常情況下傘狀細胞極少量表達[18]，UPⅢ是尿路上皮細胞的特異性標志物，三者聯(lián)合可以觀察前列腺導管內(nèi)是否存在陽性表達的尿路上皮細胞。本實驗結(jié)果表明前列腺部尿道導管開口處有CK7和UPⅢ陽性的細胞，但其陽性表達程度較膀胱尿路上皮細胞低，并且隨著前列腺導管向管腔底部延伸，該細胞表達程度逐漸減低，最后消失。本結(jié)果提示該細胞可能具有尿路上皮細胞的表型和特性，但隨著前列腺管腔向?qū)Ч艿撞垦由?，這種尿路上皮細胞的特性和功能逐漸減弱。

流式細胞學檢測結(jié)果表明SD大鼠前列腺側(cè)葉和腹側(cè)葉內(nèi)均存在UPⅢ陽性的細胞，該細胞在兩種組織內(nèi)的(55.96±3.85)%和(50.76±3.99)%。圖3中UPⅢ陽性的細胞可能就是存在于前列腺導管中的尿路上皮細胞。但是，膀胱組織內(nèi)UPⅢ陽性的尿路上皮細胞比例少于上述兩種組織，作者分析其原因在于大鼠膀胱較小，組織溶解消化不充分，單細胞數(shù)量不夠。

綜上所述，前列腺導管內(nèi)存在尿路上皮細胞，其體積大小和細胞胞質(zhì)復雜程度與膀胱尿路上皮相似，但表面?zhèn)銧罴毎Y(jié)構(gòu)與前列腺部尿道尿路上皮細胞有差異。前列腺導管內(nèi)的尿路上皮細胞CK7和UPⅢ細胞漿表達陽性。接下來作者將從細胞的亞顯微結(jié)構(gòu)、蛋白水平和核酸水平對前列腺導管內(nèi)的尿路上皮細胞進行深入研究，為研究前列腺切除術(shù)后創(chuàng)面修復的細胞來源奠定基礎(chǔ)。

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