葡萄糖二酸鈣對糖尿病腎病大鼠的治療作用及機制研究

詹明，余晶波，楊軍

糖尿病及其并發(fā)癥在全世界范圍內(nèi)的發(fā)病率不斷上升，已成為危害人類健康的主要疾病。糖尿病腎?。―N）是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，是決定糖尿病患者預(yù)后的一個主要因素。高血糖環(huán)境可導(dǎo)致腎小球和腎小管間質(zhì)的細胞外基質(zhì)積聚，腎血管壁的增厚和透明化[1]。大量研究表明腎小管的損傷和腎小球病變同樣重要，且前者是預(yù)測DN疾病進展和預(yù)后的重要指標[2]，然而目前仍缺少有效治療糖尿病腎小管病變的藥物。近期研究發(fā)現(xiàn)一種在腎小管中特異表達的蛋白，命名為肌醇加氧酶，它可將肌醇分解代謝為D-葡萄糖醛酸鹽以進入戊糖磷酸途徑[3]。除了催化葡萄糖中介體的作用之外，肌醇加氧酶被證實和DN發(fā)病機制密切相關(guān)[4]。體內(nèi)外實驗顯示高葡萄糖環(huán)境下，肌醇加氧酶的激活誘導(dǎo)腎小管細胞的氧化損傷和死亡，從而引起DN的發(fā)展和惡化[5]。因此，尋找一種能抑制肌醇加氧酶的藥物將給DN的治療帶來新的希望。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，葡萄糖二酸鈣是肌醇加氧酶潛在的藥理學(xué)抑制劑[6]。該藥物被認為具有腎臟保護作用，但對DN的治療作用和機制仍未知，相關(guān)文獻報道十分有限。因此，本研究通過建立DN大鼠模型，觀察葡萄糖二酸鈣對糖尿病大鼠腎臟的影響和藥物療效，并探討其作用的機制。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 實驗動物 選用8周齡的SD大鼠30只作為實驗組，分為鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的DN加安慰劑組（STZ+安慰劑組）和STZ誘導(dǎo)的DN加2%葡萄糖二酸鈣治療組（STZ+藥物組），另留取10只大鼠作為正常對照組。通過每天向大鼠腹腔內(nèi)注射STZ（50 mg/kg）連續(xù)5 d誘導(dǎo)糖尿病狀態(tài)，注射后1周選擇血糖水平＞250 mg/dl的大鼠作為 DN大鼠模型開始進行安慰劑或藥物治療，并在8周后處死。其中，2%葡萄糖二酸鈣為大鼠膳食食物中含質(zhì)量占2%的葡萄糖二酸鈣。

1.2 實驗方法 實驗組經(jīng)安慰劑或葡萄糖二酸鈣藥物治療8周后，取尾靜脈血通過Bioassay試劑盒進行常規(guī)的血生化檢測，包括血糖水平，反映腎功能指標的血清肌酐和血清尿素氮水平，同時留取大鼠尿液進行尿微量白蛋白與尿肌酐比值（尿ACR）檢測。

在留取血液和尿液標本后，處死大鼠，并取出腎臟組織分別制備石蠟標本和電鏡標本。石蠟標本制備通過將腎臟組織以4%多聚甲醛固定，經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋和切片，制成3m石蠟組織切片。切片進行HE和PAS常規(guī)組化染色后，在光鏡下行腎臟的病理學(xué)檢查，并進行定量評分。腎小球和腎小管損傷等級評分采用0～3分的腎臟形態(tài)損傷評分系統(tǒng)：0分為沒有腎小球/腎小管損傷；1分為＜25%的腎小球/腎小管損傷；2分為25%～50%的腎小球/腎小管受累；3分為50%及以上的腎小球/腎小管面積受累。此外，將石蠟組織切片進行肌醇加氧酶的免疫組化染色，通過去抗原，孵育一抗二抗，DAB染色和蘇木素復(fù)染等步驟，觀察肌醇加氧酶在不同組中的蛋白表達水平差異。

用于電鏡的組織標本以2.5%戊二醛固定，經(jīng)脫水、包埋、超薄切片及染色等制備電鏡標本，在透射電鏡下檢測。電鏡定位大鼠的近端腎小管上皮細胞，主要觀察不同組腎小管細胞中線粒體的動力學(xué)形態(tài)，測量線粒體的長度，＜1m為斷裂的線粒體，一個細胞若60%以上線粒體斷裂為線粒體斷裂細胞。統(tǒng)計發(fā)生上述線粒體斷裂的腎小管細胞數(shù)百分比。

1.3 統(tǒng)計方法 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組生化指標比較 STZ+藥物組的血糖水平比 STZ+安慰劑組低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而STZ+藥物組血肌酐、血尿素氮和尿ACR水平均顯著低于STZ+安慰劑組（均P＜0.05）。見表1。

2.2 兩組腎臟病理損傷評分和線粒體斷裂指標比較STZ+藥物組的腎小球損傷評分和腎小管損傷評分均顯著低于STZ+安慰劑組（均P＜0.05），且腎小管損傷的減輕程度更大；STZ+藥物組含線粒體斷裂腎小管細胞百分比低于STZ+安慰劑組（P＜0.05）。見表2。

表1 兩組生化指標比較

2.3 肌醇加氧酶蛋白表達水平比較 將未進行干預(yù)的空白對照組和兩組實驗組的腎臟石蠟標本行肌醇加氧酶免疫組化染色，并進行蛋白表達水平比較。正常對照組的肌醇加氧酶表達水平很低，而STZ+安慰劑組的表達水平顯著升高，在STZ+藥物組中肌醇加氧酶表達水平較STZ+安慰劑組低。見封二彩圖1～3。

表2 兩組腎臟病理損傷評分和線粒體斷裂指標比較

圖1 正常對照組腎臟肌醇加氧酶表達（IHC染色，×200）

圖2 STZ+安慰劑組腎臟肌醇加氧酶表達（IHC 染色，×200）

圖3 STZ+藥物組腎臟肌醇加氧酶表達（IHC 染色，×200）

3 討論

大鼠的糖尿病及其腎血管并發(fā)癥中都具有保護作用[9]。本研究結(jié)果顯示，葡萄糖二酸鈣具有治療DN的療效，且這一治療作用的機制可能是通過抑制肌醇加氧酶，從而部分恢復(fù)腎小管細胞線粒體異常形態(tài)，從而減少腎小管的氧化損傷和細胞凋亡。在大體病理上體現(xiàn)為腎小管損傷減輕，并通過管球反饋影響腎小球的病理改變。因此，本研究揭示了葡萄糖二酸鈣這一新型藥物對 DN動物的治療作用及其機制，提示該藥物具有良好的臨床應(yīng)用前景，并為今后的臨床藥物試驗奠定了堅實的實驗基礎(chǔ)。

近年來，DN以腎小球病變?yōu)橹鞯膫鹘y(tǒng)觀點已逐漸改變，研究熱點逐步轉(zhuǎn)移到了腎小管間質(zhì)損傷，且這種損傷被描述為“糖尿病腎小管病”[2]。在體內(nèi)外實驗中，靶向治療腎小管可明顯改善糖尿病引起的蛋白尿和腎功能情況，并延緩疾病的進展，提示腎小管損傷和腎小球病變在DN的發(fā)病機制中同樣重要，且兩者具有協(xié)調(diào)作用[7]。因此，探索發(fā)現(xiàn)針對腎小管的藥物對有效治療DN十分必要，且具有很大的臨床實用價值。

既往研究已經(jīng)證明，肌醇加氧酶是一種特異性定位在腎小管的氧化還原調(diào)控蛋白，在高血糖環(huán)境下肌醇加氧酶的表達上調(diào)可以通過轉(zhuǎn)錄機制調(diào)節(jié)氧化還原失衡，并且可以誘導(dǎo)線粒體依賴性細胞凋亡，這必然會導(dǎo)致腎小管間質(zhì)損傷和纖維化[4-5]。而近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)葡萄糖二酸鈣這一藥物對肌醇加氧酶的蛋白表達和活性有明顯抑制作用，且可以通過抑制肌醇加氧酶使線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)正?；?，這一事實表明葡萄糖二酸鈣在治療DN方面具有很大的潛力[8]。

值得注意的是，葡萄糖二酸鈣是一種天然化合物，在西蘭花、菠菜及蘋果等蔬菜和水果中大量存在，其具有抗癌作用。每天補充葡萄糖二酸鈣這一活性成分具有較強的解毒和抗氧化功能，其主要作用機制可能是通過其增強機體對毒素和致癌物的解毒能力。此外，葡萄糖二酸鈣的衍生物近來已被報道在

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