小劑量氯胺酮保護(hù)抑郁大鼠電休克后學(xué)習(xí)記憶中Ⅱ組促代謝型谷氨酸受體的作用☆

劉大為 閔蘇 任力

無抽搐電休克（modified electroconvulsive therapy，MECT）是治療重型抑郁癥、難治性抑郁癥的有效方法[1]，但臨床及基礎(chǔ)研究均發(fā)現(xiàn)MECT會引起抑郁癥患者或抑郁模型動物空間學(xué)習(xí)記憶功能損害[2-3]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)小劑量氯胺酮復(fù)合MECT可減輕患者及大鼠電休克后學(xué)習(xí)記憶功能損害，但其具體機(jī)制尚不清楚[3-4]。谷氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)重要神經(jīng)遞質(zhì)，在海馬神經(jīng)突觸前膜分布的Ⅱ組促代謝型谷氨酸受體 （metabotropic glutamate receptors，mGluR）可調(diào)節(jié)谷氨酸釋放[5]，突觸后膜分布的ⅡmGluR可調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性，從而可調(diào)控突觸可塑性[6-7]，與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)[8-9]。因此本研究擬通過檢測抑郁大鼠電休克處理后海馬ⅡmGluR表達(dá)及Schaffer側(cè)枝-CA1神經(jīng)通路（SC-CA1） 長時(shí)程增強(qiáng) （long-term potentiation，LTP）的變化，探討小劑量氯胺酮保護(hù)抑郁大鼠電休克后學(xué)習(xí)記憶功能中ⅡmGluR的作用。

1 材料與方法

1.1 動物選擇及建模選擇健康雄性SD大鼠，體重 200～250 g，2～3 月齡，單籠、孤養(yǎng)，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。采用慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激法（chronic unpredictable mild stress，CUMS）建立抑郁模型[10]，包括4℃冰水游泳5 min、夾尾刺激 1 min、禁水 24 h、禁食 24 h、擁擠群養(yǎng)（21只/籠）24 h、水平搖晃 20 min（搖晃 1 次/s）、持續(xù)照明 24 h、潮濕墊料 24 h、熱水（45℃）游泳5 min，每日隨機(jī)接受1種刺激，連續(xù)2 d不重復(fù)，持續(xù)28 d，應(yīng)用糖水偏好實(shí)驗(yàn)評估大鼠抑郁狀態(tài)以檢驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理

1.2.1 行為學(xué)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 選取建模成功的30只抑郁大鼠隨機(jī)分為模型組 （D組）、MECS組（M 組）、小劑量氯胺酮（10 mg/kg）復(fù)合 MECS組（KM組），并取10只同期喂養(yǎng)的健康大鼠作為對照組（C組）。腹腔注射給藥，M組丙泊酚80 mg/kg（批號：NG149，Astra Zeneca，意大利），KM 組丙泊酚80 mg/kg復(fù)合氯胺酮10 mg/kg（批號：1707033福建古田制藥廠）[4]。M組、KM組麻醉后給予電休克 （modified electroconvulsive shock，MECS） 處理（電休克治療系統(tǒng)，NiviqureMeditech，印度），總輸出電量120 mC。D組大鼠給予等量生理鹽水后兩耳夾電極但不通電，即偽ECS處理。上述處理在抑郁建模成功后每天1次，連續(xù)7 d。

1.2.2 電生理實(shí)驗(yàn) LTP是空間學(xué)習(xí)記憶的電生理基礎(chǔ)，為明確ⅡmGluR是否對抑郁大鼠空間學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的LTP有促進(jìn)作用，另取抑郁大鼠進(jìn)行電生理實(shí)驗(yàn)。選取12只建模成功的抑郁大鼠，隨機(jī)分為對照組 （P組）和ⅡmGluR阻斷劑組（L組）。P組灌流正常人工腦脊液，檢測海馬SC-CA1神經(jīng)通路LTP；L組在灌流的人工腦脊液中加入ⅡmGluR阻斷劑 LY341495（ab120400,abcam公司，英國），灌流20 min后檢測海馬SC-CA1通路LTP[7]。

1.3 大鼠行為學(xué)評價(jià)

1.3.1 糖水偏好實(shí)驗(yàn)（sucrose preference test，SPT）大鼠建模后、MECS處理后各進(jìn)行1次SPT[3]。每籠給予2瓶1%蔗糖水適應(yīng)性飲用24 h。禁食、禁水 23 h后每籠給予1瓶純水和1瓶1%蔗糖水飲用30 min。間隔1 h后，將2瓶飲水位置對換繼續(xù)飲用30 min。根據(jù)公式計(jì)算糖水偏好百分比：SPP=[糖水消耗量（mL）/(糖水消耗量（mL）+純水消耗量（mL）)]×100%。

1.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮（Morris water maze，MWM）是評估大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的重要方法[11]，大鼠建模后、MECS處理后各進(jìn)行一次MWM實(shí)驗(yàn)[3]。第1～5天進(jìn)行定位巡航實(shí)驗(yàn)，大鼠每天隨機(jī)從SE、SW、NW、NE 4個(gè)象限入水，記錄從入水到登上平臺時(shí)間為逃避潛伏期，若60 s內(nèi)未登上平臺則引導(dǎo)其登上平臺，記逃避潛伏期為60 s。以第3～5天平均值作為最終逃避潛伏期。第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，將目標(biāo)平臺移除，大鼠自SW象限入水，記錄60 s內(nèi)大鼠在NE象限游泳時(shí)間為目標(biāo)象限探索時(shí)間。

1.4 海馬 mGluR2、mGluR3水平檢測采用Westernblot法檢測各組大鼠海馬mGluR2、mGluR3濃度。大鼠MECS處理及行為學(xué)檢測結(jié)束后，斷頭取腦剝離海馬，加細(xì)胞裂解液研磨、勻漿，采用BCA法檢測蛋白濃度，每孔加樣50 μg，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。滴加小鼠抗mGluR2抗體（1:500，sc-271654，Santa Cruz公司，美國）、小鼠抗mGluR3抗體（1:500，sc-271899，Santa Cruz 公司，美國）及小鼠抗GAPDH （1:500，AF0006，碧云天公司，上海）4℃過夜。TBST沖洗，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG （1:1000，A0216，碧云天公司，上海），ECL顯色。通過Quantity One軟件進(jìn)行圖像分析，以目的蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值反映目的蛋白表達(dá)水平。

1.5 海馬SC-CA1區(qū)LTP檢測另外選取12只建模成功的抑郁大鼠隨機(jī)分為P組和L組，處死大鼠提取腦組織，采用震蕩切片機(jī)（Leica，德國）行海馬旁矢狀位切片（每片400 μm）進(jìn)行電生理檢測[12]。P組腦片灌流正常人工腦脊液，檢測SCCA1區(qū)LTP：刺激電極置于CA3區(qū)，記錄電極置于CA1區(qū)，以0.2 ms方波刺激，將刺激強(qiáng)度調(diào)至記錄到興奮性突觸后場電位 （field excitatory postsynaptic potential，fEPSP）最大值的 50%，以此刺激誘發(fā)fEPSP連續(xù)記錄30 min作為基礎(chǔ)值（baseline fEPSP），然后采用高頻刺激（high frequency stimulus，HFS）100 pulse/100 Hz行 LTP 誘導(dǎo)，LTP 記錄為HFS刺激30 min后穩(wěn)定的fEPSP相對于基礎(chǔ)值的變化率。L組腦片在基礎(chǔ)值穩(wěn)定后采用含有4 μmol/L ⅡmGluR 阻斷劑 LY341495（ab120400,abcam公司，英國）[7]的人工腦脊液灌流20 min，而后HFS誘導(dǎo)LTP，方法同前。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。大鼠SPP、第3～5天逃避潛伏期平均值、空間探索時(shí)間、mGluR2和mGluR3蛋白表達(dá)水平采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P組和L組間LTP幅度比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)指標(biāo)各組大鼠建模前SPP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=0.58，P=0.63）。建模后，SPP差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=204.95，P＜0.01），與 C 組比較，D組、M 組、KM 組 SPP均明顯降低（P＜0.01）。 實(shí)驗(yàn)處理后，各組大鼠SPP差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=145.06，P＜0.01）， 與D組相比，M 組和 KM 組 SPP升高（P＜0.01），KM 組 SPP 高于 M 組（P＜0.01）。 建模后各組大鼠逃避潛伏期（F=13.25，P＜0.01）和空間探索時(shí)間（F=24.67，P＜0.01）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與C組比較，D組、M組、KM組逃避潛伏期延長（P＜0.01），空間探索時(shí)間縮短（P＜0.01）。 實(shí)驗(yàn)處理后，各組大鼠逃避潛伏期（F=49.11，P＜0.01）和空間探索時(shí)間（F=84.02，P＜0.01）差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與D組比較，M組逃避潛伏期延長 （P＜0.01），目標(biāo)象限探索時(shí)間縮短（P＜0.01），KM 組逃避潛伏期縮短 （P＜0.01），目標(biāo)象限探索時(shí)間延長（P＜0.01）。 見表 1。

2.2 海馬mGluR2、mGluR3蛋白表達(dá)情況各組大 鼠 海 馬 mGluR2 （F=264.84，P＜0.01）、mGluR3（F=279.80，P＜0.01）蛋白表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與 C組相比，D組、M組、KM組大鼠mGluR2、mGluR3蛋白表達(dá)水平降低 （P＜0.05）；與D組相比，M組mGluR2、mGluR3蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05），而 KM 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與 M組相比，KM組大鼠海馬mGluR2、mGluR3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。 見圖 1 與表 2。

表1 CUMS建模后及實(shí)驗(yàn)處理后大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)（±s）

表1 CUMS建模后及實(shí)驗(yàn)處理后大鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)（±s）

1）方差分析后，與 C 組比較，經(jīng) LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.01；2）方差分析后，與 D 組比較，經(jīng) LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05；3）方差分析后，與 M 組比較，經(jīng)LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05

MECS處理后30.4±2.2 21.0±2.81)14.5±2.51)2)27.0±2.71)2)3)糖水偏好百分比 逃避潛伏期（s） 空間探索時(shí)間（s）組別 n C組D組M組KM組10 10 10 10 CUMS建模后87.7%±3.9%53.9%±3.8%1)52.8%±3.1%1)54.5%±4.1%1)MECS處理后88.5%±3.6%55.2%±2.8%1)69.9%±4.7%1)2)80.1%±3.7%1)2)3)CUMS建模后20.3±2.9 26.7±2.81)25.8±2.51)27.0±2.81)MECS處理后16.6±2.0 25.8±1.51)29.2±2.51)2)20.1±3.71)2)3)CUMS建模后28.2±2.7 21.0±2.61)21.1±2.51)21.5±1.81)

2.3 ⅡmGluR對海馬SC-CA1神經(jīng)通路LTP影響P組大鼠SC-CA1神經(jīng)通路LTP幅度為174.1±5.6，L 組為 156.6±5.8，P 組高于 L 組大鼠（t=8.574，P＜0.05），見圖 2。

3 討論

圖1 實(shí)驗(yàn)處理后各組大鼠海馬mGluR2、mGluR3蛋白表達(dá)水平（Western-blot法）

表2 實(shí)驗(yàn)處理后大鼠海馬ⅡmGluR蛋白相對表達(dá)量（±s）

表2 實(shí)驗(yàn)處理后大鼠海馬ⅡmGluR蛋白相對表達(dá)量（±s）

蛋白表達(dá)水平檢測以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果為蛋白相對表達(dá)量；1）方差分析后，與 C 組比較，經(jīng) LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.01；2）方差分析后，與 D組比較，經(jīng) LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.01；3）方差分析后，與 M 組比較，經(jīng) LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.01

組別C組D組M組KM組n 10 10 10 10 mGluR2/GAPDH 0.928±0.08 0.646±0.0571)0.180±0.0241)2)0.636±0.0631)3)mGluR3/GAPDH 1.088±0.082 0.589±0.0631)0.280±0.0381)2)0.585±0.0621)3)

圖2 P組、L組大鼠海馬SC-CA1神經(jīng)通路LTP。兩組大鼠HFS刺激（100 pulse/100 Hz）前后場電位變化情況；黑線為基礎(chǔ)fEPSP原始軌跡，紅線為誘導(dǎo)LTP的原始軌跡。測量標(biāo)尺：縱軸2 mV，橫軸5 ms

CUMS可較好地模擬臨床中抑郁癥的發(fā)病過程，誘導(dǎo)類似的神經(jīng)生物學(xué)改變[13]。本研究采用SPP和Morris水迷宮進(jìn)行行為學(xué)檢測，評估大鼠抑郁狀態(tài)和空間學(xué)習(xí)記憶功能。結(jié)果顯示，大鼠經(jīng)CUMS處理后表現(xiàn)出抑郁狀態(tài)，空間學(xué)習(xí)記憶功能受損；M組經(jīng)MECS處理后，空間學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)一步受損，表現(xiàn)為逃避潛伏期延長，空間探索時(shí)間縮短；而與M組相比較，復(fù)合應(yīng)用小劑量氯胺酮進(jìn)行MECS可相對縮短大鼠逃避潛伏期，延長空間探索時(shí)間，具有空間學(xué)習(xí)記憶保護(hù)效應(yīng)[3-4]。

ⅡmGluR的表達(dá)和功能與空間學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，研究顯示，重癥抑郁患者出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶能力下降，其海馬角的ⅡmGluR表達(dá)降低[14]，而ⅡmGluR基因敲除大鼠同樣出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶功能損害[9]。本研究發(fā)現(xiàn)D組大鼠海馬ⅡmGluR表達(dá)降低，出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶損害，M組大鼠ⅡmGluR表達(dá)進(jìn)一步降低，空間學(xué)習(xí)記憶損害加重，KM組ⅡmGluR表達(dá)升高，空間學(xué)習(xí)記憶功能提高。相反MARY等[15]的研究表明在前額葉注射ⅡmGluR激動劑損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶，其與本研究中升高海馬ⅡmGluR起到學(xué)習(xí)記憶保護(hù)作用不同，可能是由ⅡmGluR在不同腦區(qū)功能各異，以及大鼠的建模方式不同所引起。突觸可塑性是學(xué)習(xí)記憶的重要機(jī)制，LTP是突觸可塑性的主要表現(xiàn)形式，LTP受損往往預(yù)示學(xué)習(xí)記憶功能受損[16]。有文獻(xiàn)顯示激活突觸ⅡmGluR可通過磷脂酶C、鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ（CAMKⅡ）等一系列細(xì)胞內(nèi)途徑增強(qiáng)LTP[7]。本研究電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示采用含有ⅡmGluR特異性阻斷劑LY341495的人工腦脊液灌流抑郁大鼠海馬腦片可抑制SC-CA1神經(jīng)通路LTP，根據(jù)電生理實(shí)驗(yàn)和ⅡmGluR蛋白檢測結(jié)果推測，ⅡmGluR對抑郁大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能相關(guān)的LTP有促進(jìn)作用，抑郁大鼠MECS后出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶功能損傷可能與其降低海馬ⅡmGluR表達(dá)有關(guān)，而小劑量氯胺酮可能通過上調(diào)ⅡmGluR表達(dá)，保護(hù)電休克大鼠學(xué)習(xí)記憶。

谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)在精神失調(diào)性疾病中起重要作用，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為神經(jīng)興奮性傳遞通過谷氨酸激活突觸膜部離子型谷氨酸受體，PIN等[17]在1985年發(fā)現(xiàn)谷氨酸還可以激活某種G蛋白耦聯(lián)受體，后來將這種受體稱為促代謝型谷氨酸受體，根據(jù)序列同源性將mGluR分為3組，其中ⅡmGluR在正常皮層和海馬等與情緒和認(rèn)知功能相關(guān)的腦區(qū)突觸周圍表達(dá)豐富[6]。海馬突觸ⅡmGluR可抑制谷氨酸釋放[5]，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠電休克處理后出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶損傷與突觸間隙谷氨酸含量增加、出現(xiàn)神經(jīng)興奮性毒性有關(guān)，而小劑量氯胺酮可降低突觸間隙谷氨酸含量，保護(hù)學(xué)習(xí)記憶[4]，本研究發(fā)現(xiàn)氯胺酮調(diào)節(jié)ⅡmGluR表達(dá)可能是其調(diào)節(jié)突觸間隙谷氨酸含量的機(jī)制。ROSENBERG等[7]發(fā)現(xiàn)激活CA1區(qū)椎體細(xì)胞突觸ⅡmGluR可通過增強(qiáng)NMDA受體功能增強(qiáng)LTP，本研究顯示阻斷ⅡmGluR可降低CA1區(qū)LTP也與之相吻合。最新研究發(fā)現(xiàn)小劑量氯胺酮代謝產(chǎn)物2R,6R-去甲基氯胺酮 （2R,6R-hydroxynorketamine，2R,6R-HNK）具有抗抑郁作用[18]，本研究中KM組抗抑郁效果優(yōu)于單純MECS組，可能與氯胺酮代謝產(chǎn)物的抗抑郁作用相關(guān)。

本研究的主要不足之處在于僅從現(xiàn)象上觀察到小劑量氯胺酮復(fù)合MECS對抑郁大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響與調(diào)節(jié)ⅡmGluR表達(dá)有關(guān)，但其具體信號通路尚需進(jìn)一步研究，其次小劑量氯胺酮代謝產(chǎn)物的抗抑郁作用還需進(jìn)一步探索。

綜上所述，MECS可能通過下調(diào)海馬ⅡmGluR表達(dá)，損傷抑郁大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能，而小劑量氯胺酮可能通過上調(diào)ⅡmGluR表達(dá)，保護(hù)抑郁大鼠電休克后空間學(xué)習(xí)記憶功能。復(fù)合小劑量氯胺酮是優(yōu)化電休克抗抑郁效果，保護(hù)學(xué)習(xí)記憶的可靠方法。

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