“α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測”實驗探討*

夏 天 （浙江省余姚市第四中學(xué) 浙江余姚 315400）

“α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的檢測”是浙科版高中生物學(xué)選修1 第2 部分 “酶的應(yīng)用”中的實驗［1］。按照教材的步驟進行實驗，淀粉溶液經(jīng)固定化酶柱后的流出液遇KI-I2溶液不變色或呈淺黃色。 這可能由于過柱的流速過慢，淀粉水解反應(yīng)過于充分所致。 因為α-淀粉酶作用于淀粉內(nèi)的α-1，4-糖苷鍵，水解淀粉產(chǎn)生糊精、低聚糖、麥芽糖和葡萄糖等［2］。因此，在教學(xué)前，教師應(yīng)根據(jù)α-淀粉酶的活性進行預(yù)實驗，摸索適宜的實驗條件。

1 實驗裝置和試劑的配制

用5 mL 塑料注射器的外套、輸液器的管路和流量調(diào)節(jié)器組建實驗裝置，并固定于鐵架臺上［3］（圖1）。 使用輸液器的流量調(diào)節(jié)器代替夾子，便于控制過柱的流速。

0.05 %可溶性淀粉溶液配制：取50 mg 可溶性淀粉溶于100 mL熱水中，攪拌均勻，加熱至透明、 無沉淀，即制成淀粉膠體，冷卻后備用。溶液的配制可按比例放大。

2 實驗過程和結(jié)果

2.1 α-淀粉酶的固定化 實驗溫度為30℃。 在燒杯中將5 mg α-淀粉酶溶于4 mL 蒸餾水中。 再加入5 g 石英砂，緩慢攪拌10 min［3］，使α-淀粉酶吸附到石英砂上。將剪成合適大小的圓形濾紙片放入注射器外套底部，作為篩板（防止石英砂漏出）。 將吸附α-淀粉酶的石英砂裝入注射器外套（圖1），體積約為4 mL。用5 倍柱體積（20 mL）的蒸餾水洗滌固定化酶柱，除去未吸附的α-淀粉酶，調(diào)節(jié)流量調(diào)節(jié)器，流速為1 mL/min，約20 滴／min。

蒸餾水洗滌酶柱約5 mL 后，取1 支試管，加入5 滴流出液，再加入1 mL 可溶性淀粉溶液，混勻，反應(yīng)3 min，加入2 滴KI-I2溶液，溶液不變色，說明流出液中含有α-淀粉酶（圖2B，本文圖2、圖3 見封四）；蒸餾水洗滌酶柱約20 mL 后，再取1 支試管，加入5 滴流出液，再加入1 mL 可溶性淀粉溶液，混勻，反應(yīng)3 min，加入2 滴KI-I2溶液，溶液呈藍(lán)色，說明流出液中已不含α-淀粉酶（圖2C），可以進行后續(xù)實驗。以1 mL 可溶性淀粉溶液中加入2 滴KI-I2溶液作為對照（圖2A）。

2.2 固定化α-淀粉酶水解淀粉 實驗溫度為30℃。 將流量調(diào)節(jié)器流速調(diào)節(jié)為12 滴/min，用滴管滴加0.05%可溶性淀粉溶液。在流出5 mL 溶液后，取1 支試管接收1 mL 流出液，加入2 滴KI-I2溶液，混勻，溶液呈紅色（紫紅色）（圖3A），表明淀粉被水解為糊精。用蒸餾水稀釋1 倍后觀察，則紅色變淺（圖3B）。 以淀粉溶液中加入2 滴KI-I2溶液作為對照（圖3）。

2.3 酶柱的保存和重復(fù)使用 實驗后，用40 mL蒸餾水洗滌酶柱，取1 支試管接收1 mL 流出液，加入2 滴KI-I2溶液，溶液無顏色變化，表明酶柱沒有殘留淀粉或糊精。放置于4℃冰箱中保存。3 d 后再重復(fù)實驗，實驗結(jié)果與第1 次相同，表明固定化酶具有可重復(fù)使用的優(yōu)點。

3 結(jié)語

本實驗通過對實驗條件和步驟的優(yōu)化，使實驗現(xiàn)象明顯，實驗時間縮短，且讓實驗更易操作。主要體現(xiàn)在以下3 個方面： ①量化試劑用量。 例如，洗滌酶柱的蒸餾水用量換算為具體體積；液體的過柱流速以滴/min 為單位，方便計量。 ②用于洗去未吸附的α-淀粉酶的蒸餾水用量為20 mL（教材中為40 mL），節(jié)約了實驗時間。 ③淀粉溶液的過柱流速由“6 滴/min（0.3 mL/min）”調(diào)整為“12 滴/min”。徐平珍［4］實驗表明，流速控制在10～20 滴/min，則流出液遇KI-I2溶液呈紅色。 但預(yù)實驗是必不可少的，由于酶活性的不同，得到明顯實驗現(xiàn)象的流速會不同。 例如，本實驗中若流速為20 滴/min，則流出液遇KI-I2溶液呈藍(lán)色。