艾司西酞普蘭對MPTP誘導的帕金森病小鼠模型的神經(jīng)保護作用及其機制研究

程招弟 劉清華

1.山西醫(yī)科大學，山西太原 030001；2.山西省大同市第五人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山西大同 037000

帕金森病是繼阿爾茨海默病后第二位常見的神經(jīng)退行性疾病，主要的病理學特征是黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元不可逆的丟失和路易小體的形成。至今所有的治療手段都僅限于控制癥狀，不能阻止或延緩多巴胺能神經(jīng)元的退行性改變[1,2]。5－羥色胺（5-HT）由腸道中的腸嗜鉻細胞合成，其受體在腦中分布廣泛，張淑靜等[3]及Lindenbach D等[4]均研究證實，5-HT微量注射可以增強神經(jīng)元的興奮性，緩解PD的行為異常，Nicholson SL等[5]研究結(jié)果顯示，5-HT受體與PD的治療密切相關(guān)。但5-HT無法透過血腦屏障，腦中的5-HT幾乎完全來源于中縫核的神經(jīng)細胞所分泌，此產(chǎn)生量有限。所以，尋求一種外源性可以激活黑質(zhì)及紋狀體區(qū)5-HT受體的藥物非常重要。

艾司西酞普蘭是一個高選擇性5-HT受體再攝取抑制劑，可以通過血腦屏障，主要被用來治療抑郁癥，王燕娟等[6]在艾司西酞普蘭對AD的研究中發(fā)現(xiàn)，艾司西酞普蘭可促進受損腦區(qū)神經(jīng)元的增生、遷移，支持新生神經(jīng)細胞的發(fā)育，同時具有抗炎、抑制tua蛋白的形成，從而延緩AD的進展。張建斌等[7]對大鼠腦缺血再灌注損傷模型進一步研究顯示，草酸艾司西酞普蘭可以明顯減輕腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)損傷和改善神經(jīng)功能，具有神經(jīng)保護作用。在帕金森病模型中尚未有研究，推測其在帕金森病小鼠模型中同樣具有神經(jīng)保護作用，為帕金森病的治療提供可能的思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源

40只8周齡的SPF級雄性C57BL/6小鼠（SCXC-2014-004），動物房溫度維持在20℃～22℃，濕度 30%，小鼠保持12 h晝夜節(jié)律，自由飲食。

1.2 實驗試劑

MPTP 購于 Sigma公司，兔抗鼠 TH、BDNF、IL-1β一抗及BSA試劑盒、BCA封閉液、ECL化學發(fā)光液、二抗等均購于博士德公司。

1.3 實驗儀器

疲勞式轉(zhuǎn)棒儀購于山東科技有限公司；采用萊卡自動組織脫水機；BIO-RAD的電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀；美國Themro酶標儀；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)等。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組及模型制備 將小鼠隨機分為4個組：生理鹽水組 [0.9%NaCl 0.2 mL/（只·d）ip]；MPTP模型組[MPTP 25 mg/（kg·d） ip]；艾司西酞普蘭組[艾司西酞普蘭 10mg/（kg·d） ip]；治療組[MPTP 25 mg/（kg·d），半小時后注射艾司西酞普蘭 10 mg/（kg·d）]。 所有的注射均開始于每天清晨8時，連續(xù)注射7 d。

1.4.2 行為學檢測 滾輪實驗：滾輪實驗主要用于檢測小鼠的運動平衡能力，設(shè)置轉(zhuǎn)速為 20 r/min，時間為3 min，適應 3次后，將小鼠放于靜止的轉(zhuǎn)軸上，啟動轉(zhuǎn)棒儀并開始計時，從轉(zhuǎn)軸開始轉(zhuǎn)動到小鼠掉落計為總時間。

1.4.3 免疫組化 每組選取6只小鼠用4%的多聚甲醛進行心臟灌注，切取中腦腦組織，進行梯度脫水，石蠟包埋。黑質(zhì)區(qū)連續(xù)冠狀切片，片厚設(shè)置為 5 μm，脫蠟，高壓抗原修復，滴加抗體TH（1:200），4℃孵育過夜，后進行二抗孵育，37℃，30 min。DAB顯色，蘇木素浸染1～2 min，鹽酸酒精分化2 s，流水沖洗返藍。梯度酒精脫水，二甲苯透明，甘油封片。使用Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng),在放大200倍視野下，分別隨機選取黑質(zhì)區(qū)6張非重疊區(qū)域的腦片進行拍攝，后采用Image，Proplus圖像分析軟件進行陽性細胞計數(shù)，外側(cè)部和腹內(nèi)側(cè)部隨機選擇3個高倍視野，計數(shù)TH陽性細胞數(shù)目，取平均值。

1.4.4 Western blot每組剩余的4只小鼠采用頸椎脫臼法處死小鼠，開顱取腦留中腦部分用于Western blot檢測，組織剪碎后加入RIPA裂解組織，4℃離心，取上清，蛋白濃度測定。計算上樣量，配制等濃度、等體積蛋白液，金屬浴100℃煮蛋白（10 min），冷卻后電泳。電泳完成后半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，設(shè)置電流為膜面積×2.5 mA，恒流轉(zhuǎn)膜30～45 min。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加一抗BDNF、IL-1β于4℃冰箱搖床孵育過夜。次日，二抗室溫搖床孵育2 h。將ECL顯色液1:1混合后，反應1 min后放入顯像儀中顯影。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS17.0軟件對所得實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料均采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，符合正態(tài)分布的多組間比較采用單因素方差分析。顯著性檢驗水準取ɑ=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 行為檢測

小鼠在3 min滾輪實驗中記錄到的第一次掉落的時間，并重復三次的平均值。腹腔注射MPTP后，小鼠在滾輪上的時間明顯減少（49.5±19.2）s，與對照組相比差異顯著（P=0.000），單純注射艾司西酞普蘭組與對照組相比無差異，艾司西酞普蘭治療組與MPTP組相比，時間延長至（91.0±16.4）s （P=0.000）。說明艾司西酞普蘭可以部分逆轉(zhuǎn)MPTP所造成的C57小鼠平衡能力的缺損（圖1）。

圖1 滾輪實驗結(jié)果

2.2 免疫組化檢測黑質(zhì)致密部區(qū)TH的表達

2.2.1 TH的表達 生理鹽水對照組，黑質(zhì)區(qū)見大量TH陽性表達，腹腔注射MPTP后，黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)量明顯減少，差異顯著（57±18.12）（P=0.001）。 注射艾司西酞普蘭后TH陽性細胞數(shù)明顯高于MPTP組（73.2±14.85）（P=0.016），說明艾司西酞普蘭可以增加黑質(zhì)區(qū)TH的表達（圖2）。

圖2 黑質(zhì)區(qū)TH陽性表達免疫組化染色及統(tǒng)計分析結(jié)果

2.2.2 Westernblot檢測BDNF、IL-1β的表達 Western blot檢測結(jié)果如圖3所示，經(jīng)Image lab軟件掃描處理并進行統(tǒng)計學分析后，結(jié)果顯示：與對照組相比，MPTP組黑質(zhì)區(qū)的BDNF的表達顯著降低，同時IL-1β的表達顯著升高。而與MPTP組相比，艾司西酞普蘭組BDNF的表達顯著增高，IL-1β的表達顯著降低，該結(jié)果表明，在 MPTP誘導的PD模型，應用艾司西酞普蘭可通過上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、下調(diào)IL-1β炎性因子的表達來發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

圖3 中腦IL-1β及BDNF表達Western blot及統(tǒng)計分析結(jié)果

3 討論

目前帕金森病的治療主要以補充外源性多巴胺為主要手段，但副作用大，且不能延緩黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元退行性變，故尋求新的具有神經(jīng)保護作用的藥物尤為重要。MPTP是目前公認的制備帕金森病小鼠模型的藥物[8]，本實驗采用MPTP腹腔注射制備C57小鼠PD模型，具有明顯的行為學改變，免疫組化結(jié)果顯示，MPTP注射后，黑質(zhì)區(qū)TH的表達下調(diào)明顯，說明MPTP可造成多巴胺能神經(jīng)元缺失，并且Western blot結(jié)果顯示，黑質(zhì)區(qū)IL-1β的含量增多，分析MPTP造成的多巴胺能神經(jīng)元的損傷與炎癥反應增多有關(guān)。

以往研究表明，增加5-HT的表達，可以改善帕金森病的癥狀[9-11]。腦內(nèi)微量注射5-羥色胺可以增加神經(jīng)元興奮性，緩解PD的行為異常[12]。并且5-HT受體在腦內(nèi)廣泛分布，其中 5-HT1A、5-HT1B及5-HT2C受體與PD的發(fā)病及治療具有相關(guān)性[13]，但由于腦部合成量少，又難通過血腦屏障，故應用受限。

本實驗研究的艾司西酞普蘭是一個高選擇性5-HT受體再攝取抑制劑，可以通過血腦屏障，具有神經(jīng)保護作用。王燕娟等[6]在艾司西酞普蘭對AD的研究中發(fā)現(xiàn)，在阿爾茨海默病的動物中，SSRI可促進神經(jīng)元的增生，支持新生神經(jīng)細胞的發(fā)育，并且研究發(fā)現(xiàn)可以促神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達。本次實驗中，艾司西酞普蘭治療組與MPTP模型組相比，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF的表達上調(diào)明顯，與以往研究結(jié)果相一致，說明艾司西酞普蘭具有促神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌的功能。

BDNF是NGF家族的一種，可以增加紋狀體GABA神經(jīng)元的存活，并且可以調(diào)節(jié)突觸活性和神經(jīng)遞質(zhì)的合成，其減少可導致PD的發(fā)病[14]。給予外源性BDNF可以改善阿爾茨海默病及帕金森病的臨床癥狀。本研究結(jié)果顯示，艾司西酞普蘭可促進BDNF分泌，為PD的治療提供了一個新的可能。

Avraham SL等[15]的研究顯示，在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中草酸艾司西酞普蘭可以明顯減輕腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)損傷和改善神經(jīng)功能，且藥物干預的效果隨著時間的推移而逐步增強。本實驗結(jié)果顯示，在滾輪實驗中，經(jīng)艾司西酞普蘭治療后，小鼠在滾輪上停留的時間明顯延長，說明給予艾司西酞普蘭腹腔注射后可以部分逆轉(zhuǎn)由MPTP所致的PD小鼠的行為異常。黑質(zhì)區(qū)TH免疫組化染色顯示，與MPTP模型組相比，艾司西酞普蘭組上調(diào)TH的表達，TH是合成多巴胺的關(guān)鍵的限速酶，說明艾司西酞普蘭通過促進TH的表達從而進一步促進多巴胺的合成。此外，本次研究結(jié)果顯示艾司西酞普蘭可以下調(diào)促炎因子IL-1β的表達，說明其具有抗炎作用。

綜上所述，艾司西酞普蘭對MPTP誘導的帕金森病小鼠模型具有神經(jīng)保護作用，其作用是通過抑制炎癥、促進營養(yǎng)因子分泌來實現(xiàn)的。

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（收稿日期：2017-11-17）