一株采油細菌的培養(yǎng)條件優(yōu)化

馬添翼

摘要：本篇文章所涉及的菌株因為能夠在實驗室條件下能夠較好的釋放代謝產(chǎn)物和表面活性劑，并具有較強的產(chǎn)酸產(chǎn)氣潛力，因此可以在微生物驅(qū)油上可以有發(fā)揮的空間，因此本文對菌株的最適培養(yǎng)條件進行了研究和探討。確定了該菌株的最適發(fā)酵條件，從而確定了該微生物在石油工業(yè)上應(yīng)用的潛質(zhì)。

關(guān)鍵詞：微生物采油；表面活性劑；培養(yǎng)基優(yōu)化

微生物采油技術(shù)（Microbial Enhanced Oil Recovery簡稱MEOR）是提升油井采收率的三次采油手段，它通過利用微生物的代謝產(chǎn)物以及代謝活動作用于巖石和液體使殘余原油產(chǎn)出，從而達到提高原油采收率的目的。[1]MEOR技術(shù)因其低能耗、環(huán)保、可持續(xù)的優(yōu)勢在國內(nèi)外得到長期的發(fā)展。[2]比起傳統(tǒng)的驅(qū)采油法，微生物采油更能夠降低原油的附著力同時達到原油增產(chǎn)的目的。[3]一般意義上的微生物代謝產(chǎn)生聚合物、有機溶劑、二氧化碳以及生物表面活性劑伴隨著水驅(qū)法通過注水井注入油層內(nèi)進行有效驅(qū)油。[4]其中生物表面活性劑是一類由微生物代謝產(chǎn)生的具有親水基團和疏水基團的兩親化合物。[5～6]生物表面活性劑具有高表面活性與環(huán)境穩(wěn)定性、可降解、低毒等優(yōu)點。[7]有研究表明，能夠產(chǎn)生表面活性劑的微生物種類豐富，所產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)多樣。[8]因此在石油的降解、提高原油采收率、重油污染土壤的生物修復(fù)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。[9～10]菌株B1是從油田礦水中分離提取出的具備MEOR潛力的高性能菌株，初步鑒定B1為一株芽孢菌，因為不確定其最適產(chǎn)表面活性劑的條件，故對它的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1菌株

芽孢菌B1：分離自長慶油田某區(qū)塊的油水樣品，肉湯斜面保藏于4℃。

1.1.2培養(yǎng)基

初始種子培養(yǎng)基為肉湯培養(yǎng)基，初始產(chǎn)表活培養(yǎng)基為芽孢產(chǎn)表活培養(yǎng)基。

1.2 實驗方法

1.2.1菌株種子培養(yǎng)基的優(yōu)化

采用正交試驗方法找出B1相對較優(yōu)異的種子培養(yǎng)基，將菌株由保藏斜面轉(zhuǎn)接至活化24h后接入種子培養(yǎng)基，然后以5%的接種量接入正交試驗中所涉及的各實驗組的培養(yǎng)基，在35℃，150rpm的條件下?lián)u床24h后，測定OD600值，最后通過極差排列的順序和方差分析各組分對菌體濃度的影響是否達到顯著水平，最后確定出培養(yǎng)基的最佳配比。

1.2.2芽孢菌的產(chǎn)表活培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.2.1單因素實驗確定最佳培養(yǎng)基配比

按照表2配制培養(yǎng)基16組后，按5%的比例接入種子液，搖床培養(yǎng)28h后測定發(fā)酵液的OD600值和表面張力變化值。

2.1 菌株種子培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

最后確定出培養(yǎng)基的最佳配比為：葡萄糖 4g/L、NaCl 5g/L、酵母膏1.0g/L、蛋白胨 7g/L、牛肉膏 3g/L。

2.2 芽孢菌的產(chǎn)表活培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.2.1單因素實驗確定最佳培養(yǎng)基配比

通過實驗結(jié)果和數(shù)據(jù)對比，發(fā)現(xiàn)去除Mg2+和Ca2+后OD600值有所下降（但不明顯），但是并沒有對菌株產(chǎn)表面活性劑能力有多少影響，因主要是衡量菌株產(chǎn)表面活性劑的指標，因此可從培養(yǎng)基成分中去除；簡并N、P源實驗中，簡并后的培養(yǎng)基培養(yǎng)出的發(fā)酵液雖然OD600值下降了16.1%，表面張力值γ下降了8%，排油圈直徑減小了0.3cm。但是極大的降低了培養(yǎng)成本，同時表面張力值雖然下降但未過10%。因此得出簡并N、P源后的方案經(jīng)濟可行；在生長因子優(yōu)化實驗中，如下圖所示，“酵母膏加玉米漿”的組合得到的表活產(chǎn)量最高，γ的變化值可以達到2.42×102N/m，同時測量排油圈直徑為6.6cm。可溶性淀粉+玉米漿的組合能使菌體量達到最大，測量OD600值為0899，雖然表活指標相對實驗一有所劣勢，但是綜合考慮成本因素故選取第四組配方（淀粉20g/L、（NH4） 2HPO4 10g/L、玉米漿4g/L）作為B1菌的最佳發(fā)酵液配方。

不同實驗組中的B1菌株生長情況和表活對比圖

2.2.2正交法優(yōu)化B1菌的培養(yǎng)基結(jié)果

正交試驗的結(jié)果為表面張力檢測結(jié)果的極差大小排序為：A（淀粉（玉米槳）>B （（NH4） 2HPO4）；理論最佳組合為“25g/L 淀粉+10g/L （NH4） 2HP04+2g/L玉米槳”。方差分析表明，淀粉對表活的產(chǎn)量影響達到顯著水平。OD600結(jié)果的極差排列順序為：A（淀粉）>B （（NH4） 2HPO4） >C （玉米槳），且只有淀粉對各組OD600的影響達到顯著性，理論最佳組合為“25g/L淀粉+18g/L （NH4） 2HP04+2g/L玉米槳”。因此，最佳配方“25g/L”淀粉+10g/L （NH4） 2HP04+4g/L玉米槳”，能使表活產(chǎn)量達到最高的同時菌體數(shù)量也接近最高值。

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