米諾膦酸原料藥中4種有機(jī)殘留溶劑的毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定

楊鎮(zhèn)偉， 林琪， 吳振， 劉智陽， 王立強(qiáng)

(1. 華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 福建 泉州 362021；2. 廈門大學(xué) 藥學(xué)院， 福建 廈門 361102；3. 中銘生物(深圳)集團(tuán)有限公司， 廣東 深圳 518101)

米諾膦酸(minodronic acid)是一種雙膦酸鹽化合物，為日本小野藥品株式會(huì)社和日本Astellas制藥株式會(huì)社共同研究開發(fā)，可用于治療原發(fā)性和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥[1].作為第三代雙磷酸鹽類抗骨吸收劑，米諾膦酸能夠抑制破骨細(xì)胞法尼焦磷酸合成酶(FPP)的活性，降低骨轉(zhuǎn)換，進(jìn)而防治骨質(zhì)疏松[2-4].據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其抑制骨吸收的體外活性約為依地膦酸鹽的10 000倍，阿侖膦酸鹽的10～100倍[5].在諸多藥物的合成過程中需使用有機(jī)溶劑，這些有機(jī)溶劑對(duì)人體存在不同程度的毒性，當(dāng)原料藥及制劑中殘留有機(jī)溶劑超過安全水平，則會(huì)對(duì)人體造成損害.因此，為了提高藥物的安全性，對(duì)原料藥及制劑中殘留溶劑的檢測(cè)至關(guān)重要.

目前，國內(nèi)已有對(duì)米諾膦酸含量測(cè)定及有關(guān)物質(zhì)測(cè)定的報(bào)道[6-8]，米諾膦酸也有多種合成路線[9-10].然而，有關(guān)米諾膦酸中殘留溶劑檢測(cè)的報(bào)道僅有吳素平等[11]，即對(duì)四氫呋喃、乙酸乙酯、甲醇、乙腈和甲苯等5種殘留溶劑進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)限分別為0.16，0.10，1.19，0.22，0.02 μg·mL-1.甲醇、二氯甲烷和甲苯屬于第二類有機(jī)溶劑，乙醇屬第三類有機(jī)溶劑，目前尚無長期毒性試驗(yàn)結(jié)果.關(guān)于藥物中乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯等殘留溶劑檢測(cè)的報(bào)道有許多，如張巍等[12]對(duì)依帕司他中有機(jī)殘留溶劑的檢測(cè)，裴麗娟等[13]對(duì)布南色林原料藥中9種有機(jī)殘留溶劑的檢測(cè)等.但這些對(duì)乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯等殘留溶劑的檢測(cè)限均較高.本文采用袁淑杰米諾膦酸合成新工藝制備米諾膦酸原料藥[14]，并對(duì)合成過程中使用的乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯等4種有機(jī)殘留溶劑進(jìn)行定量分析.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

毛細(xì)管氣相色譜儀(氫火焰離子檢測(cè)器，浙江福立分析儀器股份有限公司)；電子天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；超聲波清洗儀(河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯均為色譜級(jí)，水為超純水，其余試劑均為市售分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.1.1 色譜條件 采用安捷倫DB-624(0.32 mm×30 m， 3 μm)色譜柱；固定液為6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷；初始溫度為40 ℃，保持3 min，以15 ℃·min-1持續(xù)升溫至200 ℃，并保持10 min；檢測(cè)器溫度為200 ℃，進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為N2，柱流量為1.5 mL·min-1；采用直接進(jìn)樣法測(cè)定.

1.1.2 溶液的配制 1) 供試品溶液的配制.分別精密稱取乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯，置于100 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺分別稀釋制備成濃度為0.500，0.300，0.060和0.089 mg·mL-1的溶液，作為峰定位試驗(yàn)的供試品溶液.2) 線性母液的配制.分別精密稱取乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯，用N，N-二甲基甲酰胺分別稀釋制備成濃度為50.0，30.0，6.0和8.9 mg·mL-1的溶液，作為線性母液.3) 混合溶液的配制.分別精密稱取乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯，用N，N-二甲基甲酰胺稀釋制備成濃度分別為50.0，30.0，6.0和8.9 mg·mL-1的混合溶液.4) 對(duì)照品母液的配制.分別精密稱取乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯，用N，N-二甲基甲酰胺分別稀釋制備成濃度為5.00，3.00，0.60和0.89 mg·mL-1的溶液，作為對(duì)照品母液.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性考察

分別精密量取1 μL供試品溶液及N，N-二甲基甲酰胺，注入毛細(xì)管氣相色譜儀，其毛細(xì)管氣相色譜(GC)圖如圖1(a)～(e)所示.圖1(a)～(e)中：A為峰面積；t為洗脫時(shí)間，下同略.由圖1(a)～(e)可知：乙醇的保留時(shí)間為5.116 min，甲醇的保留時(shí)間為4.359 min，二氯甲烷的保留時(shí)間為6.130 min，甲苯的保留時(shí)間為11.138 min，N，N-二甲基甲酰胺的保留時(shí)間為12.405 min.

精密量取1 mL混合溶液于容量瓶，用N，N-二甲基甲酰胺定容至刻度，搖勻，取1 μL注入毛細(xì)管氣相色譜儀，其毛細(xì)管氣相色譜(GC)圖如圖1(f)所示.由圖1(f)可知：本品各主峰之間的分離度均符合規(guī)定.因此，上述毛細(xì)管氣相色譜條件，可用于本品的溶劑殘留檢查.

(a) 空白溶劑 (b) 乙醇

(c) 甲醇 (d) 二氯甲烷

(e) 甲苯 (f) 混合溶液圖1 不同溶液的毛細(xì)管氣相色譜圖Fig.1 Capillary gas chromatograms of different solutions

2.2 線性關(guān)系和檢出限的考察

分別精密量取0.2，0.5，1.0，2.0和4.0 mL的中線性母液，放置于100 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺稀釋定容，并振蕩搖勻，作為線性溶液.然后，分別精密量取1 μL線性溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖及峰面積.以各個(gè)峰面積(A)作為縱坐標(biāo)，以線性溶液的濃度(c)作為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)(R2).4種溶劑分別用N，N-二甲基甲酰胺稀釋直至峰高與基線噪音的比值約為3時(shí)，記錄樣品濃度即檢測(cè)限，結(jié)果見表1所示.

表1 不同溶劑的線性關(guān)系及其檢出限Tab.1 Linear relationship of different solvents and their detection limits

2.3 精密度試驗(yàn)

分別精密量取1 mL混合溶液，放置于100 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺稀釋定容，并振蕩搖勻.精密量取上述溶液1 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果如表2所示.表2中:DRS為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差.從表2可知：精密度試驗(yàn)結(jié)果良好.

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of precision test

2.4 回收率試驗(yàn)

1) 本底值測(cè)定供試品溶液的制備.精密稱取米諾膦酸約1.0 g，溶解并放置于10 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺稀釋定容，振蕩搖勻，即得.2) 回收率供試品溶液的制備.分別精密稱取米諾膦酸6份，溶解并放置于10 mL量瓶中，加入1 mL的對(duì)照品母液，用N，N-二甲基甲酰胺溶解并稀釋定容，振蕩搖勻，即得.3) 對(duì)照品溶液的制備.精密量取對(duì)照品母液1 mL，放置于10 mL量瓶中，用N，N-二甲基甲酰胺稀釋定容，振蕩搖勻，即得.

分別精密量取對(duì)照品溶液、本底值測(cè)定供試品溶液和回收率供試品溶液各1 μL，進(jìn)樣，記錄色譜圖及峰面積，按照外標(biāo)法計(jì)算測(cè)得量.計(jì)算樣品的回收率，結(jié)果如表3所示.表3中：m1為加入量；m2為測(cè)定量；η為回收率；DRS為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差.從表3可知：本品的回收率試驗(yàn)結(jié)果良好.

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Recovery test results

2.5 小試3批樣品的殘留溶劑測(cè)定

根據(jù)人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求，以及國際協(xié)調(diào)會(huì)(ICH)[15]和《中華人民共和國藥典： 四部(2020年版)》[16]中甲醇的限量不超過0.3%，乙醇的限量不超過0.5%，二氯甲烷的限量不超過0.06%，甲苯的限量不超過0.089%.按照色譜條件對(duì)本品3批小試樣品進(jìn)行溶劑殘留測(cè)定，如表4所示.從表4可知：3批小試樣品中均未檢出4種殘留溶劑，表明小試3批樣品的上述溶劑殘留均符合規(guī)定.

表4 小試3批樣品殘留溶劑測(cè)定結(jié)果Tab.4 Determination results of residual solvent in 3 batches of small test samples

2.6 溶劑選擇

為了精確檢測(cè)米諾膦酸原料藥中殘留溶劑的含量，需選擇一種合適的溶劑，既能完全溶解米諾膦酸又可完全溶解有機(jī)溶劑.因此，對(duì)二甲基亞砜、水、氫氧化鈉溶液、N，N-二甲基甲酰胺等溶劑進(jìn)行考察，結(jié)果顯示米諾膦酸在二甲基亞砜中幾乎不溶，在水中微溶，在氫氧化鈉溶液中易溶，在N，N-二甲基甲酰胺中溶解.然而，由于堿性溶液直接進(jìn)樣會(huì)污染內(nèi)襯管，容易損壞色譜柱，且米諾膦酸在N，N-二甲基甲酰胺溶液中回收率能達(dá)到95%以上.因此，文中選擇N，N-二甲基甲酰胺作為溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

2.7 進(jìn)樣方式選擇

根據(jù)《中華人民共和國藥典： 四部(2020年版)》[16]中殘留溶劑測(cè)試方法，選擇直接進(jìn)樣法.溶液直接進(jìn)樣法無需前處理過程，簡單快速、精密度高，且重復(fù)性好.實(shí)驗(yàn)過程中測(cè)定4種有機(jī)溶劑的檢測(cè)限，乙醇、甲醇、二氯甲烷和甲苯的檢測(cè)限分別為0.029，0.052，0.051，0.051 ng.結(jié)果表明，該方法檢測(cè)限低，靈敏度高，因此可選擇溶液直接進(jìn)樣法進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

2.8 色譜柱選擇

(a) DB-1701色譜柱

(b) DB-1301色譜柱 (c) DB-624色譜柱圖2 不同毛細(xì)管色譜柱的GC圖譜Fig.2 GC spectra of different capillary columns

DB-1701毛細(xì)管色譜柱是一款(14% 氰丙基-苯基)-甲基聚硅氧烷色譜柱，DB-1301 毛細(xì)管色譜柱與DB-1701毛細(xì)管色譜柱類似，是一款(6% 氰丙基-苯基)-甲基聚硅氧烷色譜柱，二者均具有較低至中等極性；DB-624毛細(xì)管色譜柱則是一款高惰性色譜柱，該色譜柱可用于快速 GC/MS分析，專門為了分析揮發(fā)性物質(zhì)和殘留溶劑而設(shè)計(jì)的，對(duì)活性化合物具備優(yōu)良的惰性.3種色譜柱均經(jīng)過鍵合交聯(lián)，均可使用溶劑沖洗.

采用進(jìn)樣混合溶液，分別考察安捷倫DB-624，DB-1701，DB-1301等3種毛細(xì)管色譜柱的分離效果，結(jié)果如圖2所示.由圖2可知：采用安捷倫DB-1701色譜柱得到的色譜圖峰型差、靈敏度低；采用DB-1301色譜柱得到的色譜圖峰型較好，但靈敏度同樣較低；采用安捷倫DB-624色譜柱分離得到的峰型較好，且靈敏度高、出峰時(shí)間短、分離度好.因此，選用安捷倫DB-624色譜柱作為實(shí)驗(yàn)色譜柱.

3 結(jié)束語

實(shí)驗(yàn)建立了米諾膦酸中乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯等4種殘留溶劑的含量測(cè)定方法.該方法精密度好、準(zhǔn)確度高，可為米諾膦酸原料藥及米諾膦酸片劑的質(zhì)量控制提供參考依據(jù).通過對(duì)3批米諾膦酸原料藥的小試樣品進(jìn)行殘留溶劑的檢測(cè)，結(jié)果表明，3批米諾膦酸原料藥中均未檢出乙醇、甲醇、二氯甲烷、甲苯等4種殘留溶劑，符合《中華人民共和國藥典： 四部(2020年版)》[16]的原料藥質(zhì)量要求.接下來的研究將會(huì)測(cè)試采集到的車間生產(chǎn)樣品，進(jìn)一步考察該方法的實(shí)際可行性和適用性.