超敏乙肝DNA檢測(cè)對(duì)HBcAg陰性HBV感染者的診治意義

楊娜　袁濤　張囡囡

【摘要】目的：比較傳統(tǒng)PCR法與超敏乙肝DNA檢測(cè)方法對(duì)HBeAg陰性HBV感染者檢出率的差異，探討超敏乙肝DNA檢測(cè)在乙肝診治中的優(yōu)勢(shì)。方法：收集本院HBeAg陰性HBV感染者436例，其中代償期肝硬化組39人，慢乙肝組178例，HBcAb+查體組219例，同時(shí)用傳統(tǒng)PCR法和超敏乙肝DNA檢測(cè)方法檢測(cè)其病毒含量，比較其差異。結(jié)果：代償期肝硬化組傳統(tǒng)PCR法及超敏乙肝PCR陽性檢出率為分別為69.23%及92.31%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X²=5.283，P=0.02%0.05）；慢乙肝組兩種檢測(cè)法陽性檢測(cè)率分別為2.80%及11.80%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X²=9.336，P=0.001%0.05）；HBcAb+查體組分別為0.46%和1.83%，兩組比較差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X²=1.821，P=0.177>0.05）。結(jié)論：超敏乙肝DNA檢測(cè)在慢性HBV患者抗病毒指導(dǎo)、病毒學(xué)應(yīng)答評(píng)估、核苷類藥物耐藥預(yù)測(cè)及隱匿性肝炎的檢出方面具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】超敏乙肝DNA檢測(cè)方法；傳統(tǒng)PCR法；HBeAg（-）

HBeAg陰性CHB是由于HBV發(fā)生變異和（或）宿主免疫壓力下形成的一種特殊的CHB臨床類型，發(fā)病隱匿，臨床癥狀不明顯，病毒含量較低，相對(duì)于HBeAg陽性CHB，這類患者年齡更大，病史更長(zhǎng)，肝臟纖維化程度較重，而且對(duì)抗病毒治療的持久應(yīng)答率更低，更易進(jìn)展為肝硬化和HCC。及時(shí)有效抗病毒治療是控制病情及預(yù)防不良預(yù)后的重要手段。HBV DNA定量檢測(cè)主要用于判斷慢性HBV感染的病毒復(fù)制水平，是評(píng)估乙肝感染狀態(tài)、傳染性強(qiáng)弱、病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，可用于抗病毒治療適應(yīng)證的選擇及療效的判斷，并且在乙肝病毒變異耐藥預(yù)測(cè)具有重要意義，既往多項(xiàng)研究表明超敏法的檢測(cè)靈敏度顯著高于傳統(tǒng)方法。本文作者通過比較傳統(tǒng)PCR法與超敏乙肝DNA檢測(cè)方法對(duì)HBeAg陰性HBV感染者檢出率的差異，探討超敏乙肝DNA檢測(cè)在乙肝診治中的優(yōu)勢(shì)，內(nèi)容如下。

1資料與方法

1.1一般資料

收集本院2016年1月至2017年6月HBeAg陰性HBV感染者共436例，其中男性240例，女性196例，平均年齡（42±8.5）歲。所有患者（乙型肝炎肝硬化代償期、慢性乙型病毒性肝炎）均符合《2015年慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)，肝癌、合并其它病毒感染、口服免疫抑制劑患者除外。代償期肝硬化組患者39例，為HBeAg陰性乙型肝炎肝硬化代償期初治患者，乙肝五項(xiàng)指標(biāo)為HBsAg+，HBsAb-，HBeAg-，HBeAb+，HBcAb+；慢性乙型病毒性肝炎組共178例，為HBeAg陰性慢性乙型病毒性肝炎患者，口服核苷類似物療程24～48周，乙肝五項(xiàng)指標(biāo)為HBsAg+，HBsAb-，HgeAg-，HBeAb+或-，HBcAb+；HBcAb+查體組共219例，乙肝五項(xiàng)指標(biāo)示HBsAg-，HBsAb-或+，HBeAg-，HBeAb-或+。HBcAb+。

1.2方法

同時(shí)采集空腹外周靜脈血標(biāo)本2份各4mL，常規(guī)離心分離獲得血清，每份血清標(biāo)本同時(shí)采用超敏法和傳統(tǒng)外標(biāo)法對(duì)血清中HBV DNA進(jìn)行定量檢測(cè)。

超敏法（Sensitive）：儀器包括NP968-C自動(dòng)核酸提取儀和TL988-Ⅳ擴(kuò)增儀，試劑使用蘇州天隆生物科技有限公司的核酸定量檢測(cè)試劑盒（熒光PCR法）。最低檢測(cè)值低于10IU/mL。

傳統(tǒng)PCR法（Traditional）：試劑采用中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司的乙型肝炎病毒核酸定量檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針法），檢測(cè)儀器使用中山達(dá)安DA7600PCR儀。最低檢測(cè)值低于500IU/mL。

兩種方法核酸提取及檢測(cè)過程均按照相應(yīng)試劑盒及儀器的操作說明進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

代償期肝硬化組傳統(tǒng)PCR法陽性檢出率為69.23%（27/39），超敏乙肝PCR檢測(cè)法陽性檢出率為92.31%（36/39），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X²=5.283，P=0.02<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。慢性乙肝組傳統(tǒng)PCR法陽性率2.80%（5/178），超敏乙肝PCR檢測(cè)法在陽性檢出率為11.80%（21/178），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X²=9.336，P=O.001<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HBcAb+查體組傳統(tǒng)PCR法和超敏乙肝PCR檢測(cè)法在陽性檢出率上分別為0.46%（1/219）和1.83%（4/219），兩組比較差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X²=1.821，P=0.177>0.05）。見表1。

3討論

HBV DNA定量檢測(cè)主要用于判斷慢性HBV感染的病毒復(fù)制水平，可用于抗病毒治療適應(yīng)證的選擇及療效的判斷。2015年慢性乙型肝炎防治指南建議采用靈敏度和精確度高的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative PCR）法。超敏HBVDNA定量檢測(cè)系統(tǒng)采用磁珠吸附法全自動(dòng)核酸提取系統(tǒng)對(duì)血清標(biāo)本進(jìn)行核酸提取純化，回收率高，重復(fù)性好，減少了人為誤差；定量方法采用內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)品，在檢測(cè)前加入每一個(gè)臨床血清標(biāo)本中，與標(biāo)本同時(shí)提取和擴(kuò)增，一方面，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線對(duì)乙肝病毒DNA進(jìn)行定量，另一方面，消除了由于核酸提取、擴(kuò)增效率不同而造成的管間差異，檢測(cè)靈敏度更高，定量線性范圍更寬，定量結(jié)果更準(zhǔn)確、可靠，從而準(zhǔn)確定量低載量HBV DNAE。

指南指出，對(duì)于存在肝硬化證據(jù)HBV DNA陽性患者，無論ALT及HBeAg情況，均建議積極抗病毒治療。本次研究顯示HBeAg肝硬化代償期患者傳統(tǒng)PCR法檢出率為69.23%，超敏乙肝PCR檢測(cè)法陽性檢出率為92.31%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示：1）HBeAg陰性乙肝肝硬化患者病毒載量低；2）超敏乙肝PCR檢測(cè)法可更準(zhǔn)確指導(dǎo)乙肝肝硬化代償期抗病毒治療，進(jìn)而早期控制病毒，延緩肝硬化進(jìn)展，預(yù)防肝癌、肝衰竭等不良事件發(fā)生。

高效低耐藥核苷（酸）類似物較干擾素副作用小，用藥方便，是目前抗病毒治療的一線用藥?？诜塑疹愃莆锼幬锟共《镜穆訦BV患者，于治療過程中，需觀察病毒應(yīng)答情況以評(píng)估藥物療效及疾病轉(zhuǎn)歸，其應(yīng)答不佳、突破及反彈是乙肝病毒變異、核苷類藥物耐藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)判指標(biāo)。本研究顯示口服核苷類藥物（24～48周）HBeAg陰性慢性乙肝患者超敏乙肝PCR檢測(cè)陽性率高于傳統(tǒng)PCR法（11.80%>2.80%），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示：1）HBeAg慢乙肝患者口服高效低耐藥核苷類似物24～48周病毒學(xué)應(yīng)答率高，但仍有部分應(yīng)答不佳；2）超敏乙肝PCR檢測(cè)法可早期發(fā)現(xiàn)耐藥風(fēng)險(xiǎn)，有利于病情預(yù)后評(píng)估。在進(jìn)一步的隨訪研究中可定期監(jiān)測(cè)陽性患者病毒應(yīng)答情況，了解有無耐藥發(fā)生及病情轉(zhuǎn)歸。

隱匿性CHB是血清HBsAg陰性，但血清和（或）肝組織中HBVDNA陽性，并有CHB的臨床表現(xiàn)。除HBV DNA陽性外，患者可有血清抗-HBs、抗-HBe和（或）抗-HBc陽性，但約20%隱匿性CHB患者的血清學(xué)標(biāo)志物均為陰性。診斷主要通過HBV DNA檢測(cè)，尤其對(duì)抗-HBc持續(xù)陽性者。隱匿性肝炎多與HBSAg變異相關(guān)，發(fā)生率低，臨床表現(xiàn)不明顯，其檢查率及檢出率較低，進(jìn)而耽誤治療。本研究就HB-sAg陰性及抗-HBc陽性患者同時(shí)進(jìn)行傳統(tǒng)PCR法和超敏乙肝DNA檢測(cè)方法，結(jié)果顯示超敏檢測(cè)法檢出率較高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。原因考慮以下方面：1）樣本量少；2）隱匿性肝炎發(fā)病率低；3）隱匿性肝炎病毒含量低。

綜上所述，超敏乙肝DNA檢測(cè)在慢性HBV患者抗病毒指導(dǎo)、病毒學(xué)應(yīng)答評(píng)估、核苷類藥物耐藥預(yù)測(cè)及隱匿性肝炎的檢出方面具有重要意義。