地稔根際根腐線蟲的形態(tài)和分子鑒定

王宏洪 黃少彬 楊曉朱 廖金鈴

摘 要 2013—2016年，廣東和廣西植物線蟲種類調查期間，從地稔（Melastoma dodecandnun）根部和根際土壤中分離到一種根腐線蟲。經形態(tài)學觀察、rDNA （LSU D2D3和ITS） 序列分析和系統發(fā)育分析，將其鑒定為最短尾短體線蟲（Pratylenchus brachyurus）。最短尾短體線蟲是全球最重要的11種根腐線蟲之一。地稔是最短尾短體線蟲的新寄主。地稔根際線蟲類群調查與鑒定，可為地稔線蟲病害的發(fā)生與控制提供數據基礎。

關鍵詞 地稔；最短尾短體線蟲；根腐線蟲；形態(tài)學；新寄主

中圖分類號 S432 文獻標識碼 A

Abstract A species of root lesion nematode was isolated from the root of Melastoma dodecandrum and the rhizosphere soil during the survey of plant nematodes in Guangdong and Guangxi. Combined morphological study， sequence analysis of rDNA （LSU D2D3 and ITS） and phylogenetic analyses revealed the species was Pratylenchus brachyurus. P. brachyurus is one of the 11 most important root lesion nematodes in the world. M. dodecandrum is a new host record for P. brachyurus. The investigation and identification of plant nematodes assocated with M. dodecandnun can provide a basis for controlling the diseases.

Keywords Melastoma dodecandrum； Pratylenchus brachyurus； root-lesion nematode； morphology； new host record

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.021

短體線蟲（Pratylenchus spp.）是遷移性根內寄生線蟲，通常被稱作根腐線蟲，能夠穿刺和取食皮層薄壁細胞，引起根部壞死，阻礙水分和營養(yǎng)的吸收與運輸，導致根系統功能喪失[1]。由根腐線蟲引起的損傷可作為病原菌侵入的通道，致使寄主根部的大面積腐爛，形成更加嚴重的復合病害[2]。根腐線蟲種類繁多，形態(tài)多樣，寄主廣泛，是一類危害僅次于根結線蟲（Meloidogyne spp.）和孢囊線蟲（Heterodera spp. 和Globodera spp.）的植物寄生線蟲[3]。

地稔（Melastoma dodecandnun Lour.）為野牡丹科植物，俗名山地稔、地葡萄、鋪地錦、落地稔和地茄等，分布于廣東、廣西、貴州、湖南、江西、浙江、福建等地區(qū)，生于酸性土壤的山坡路旁[4]。地稔有良好的藥用價值，味甘、澀，性另外，地稔還被認涼，具有活血止血、消腫祛瘀和清熱解毒的功效[5]。為是一種優(yōu)良的野生觀花地被植物[6-7]。目前，尚未見地稔病蟲害的報道[8]。2013—2016年，廣東和廣西植物線蟲的調查期間，在地被植物地稔根際采集了6個土壤樣品，其中2個樣品中發(fā)現根腐線蟲，本研究通過形態(tài)學觀察和分子生物學分析將其鑒定到種。

1 材料與方法

1.1 種群來源

樣品采自廣東石門國家森林公園（2016年6月，廣州市從化區(qū)）和廣西農墾國有新光農場（2013年6月，欽州市靈山縣）。用小鐵鏟在成片地稔中央挖取根系，以及表層10 cm根際土壤約500 g。樣品裝于塑料自封袋，寫好標簽，做好GPS定位，廣東種群SMDL（23°39′10.25″N，113°45′16.30″E）和廣西種群GX630（22°17′ 25.52″N，108°53′ 30.06″E）。

1.2 方法

1.2.1 線蟲分離、標本制作、形態(tài)觀察與測量 土壤混勻后稱取200 mL，根系剪成0.5 cm小段后稱取2 g，經改進的貝曼漏斗法分離24～48 h。在體式顯微鏡下，將根系和土壤樣品中的分離到的根腐線蟲挑入裝有清水的指形管中。經熱殺死（60～65 ℃水浴2～3 min）、4%甲醛固定和甘油酒精法脫水后，用蠟圈法進行標本制作[9]。利用尼康科研級正置顯微鏡（ECLIPSE 90i，Nikon，日本）對線蟲標本進行形態(tài)觀察、數據測量和拍照[10]。

1.2.2 DNA抽提、擴增和測序 采用蛋白酶K法進行單條線蟲DNA抽提[11]。LSU D2D3擴增引物為D2A（5′-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGT-3′）和D3B （5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′） [12]，ITS擴增引物為18S （5′-TTGATTACGTCCCTG-CCCTTT-3′）和26S（5′-TTTCACTCGCCGTTA-CTAAGG-3′）[13]。PCR反應體系參照Ex Taq酶說明書（Ex Taq?，TAKARA，日本），50 μL PCR體系中DNA模板為4 μL。PCR程序：95 ℃ 預變性5 min，（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min）39個循環(huán)，72 ℃ 10 min。PCR結果用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，試劑盒切膠回收PCR產物（EasyPure PCR Purification Kit，全式金生物，北京）。純化的rDNA片段克隆到T載體（PMD-18T vector，TAKARA，日本），再轉化到DH5α菌株后，挑取陽性克隆送至艾基生物技術（廣州）有限公司測序。利用Lasergene 7.0軟件對測序結果進行分析和拼接，然后上傳至GenBank數據庫，序列號分別為MG745329（廣東種群 28S rDNA D2D3）、MG745330 （廣西種群

28S rDNA D2D3）、MG738355（廣東種群 rDNA- ITS）和MG738356（廣西種群 rDNA-ITS）。

1.2.3 系統發(fā)育關系分析 參考已發(fā)表的短體線蟲系統發(fā)育研究文獻[14-16]，下載短體線蟲rDNA （LSU D2D3和ITS）序列。利用MEGA 6.0進行序列比對，PAUP 4.0和Modeltest 3.7選擇核酸替代模型，MrBayes 3.2構建系統發(fā)育樹、Treeview 1.6打開和編輯系統發(fā)育樹[10]?；?8S rDNA D2D3區(qū)系統發(fā)育樹的外組選擇參考Wang等[11]，基于rDNA-ITS區(qū)系統發(fā)育樹的外組選擇刻痕短體線蟲[Pratylenchus crenatus Loof， 1960 （FJ712912）]。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)鑒定

形態(tài)特征圖片見圖1，形態(tài)測量值見表1。

雌蟲（SMDL種群）：熱殺死后蟲體略腹彎。唇區(qū)略縊縮，前緣明顯呈角狀，唇環(huán)兩個。側區(qū)四條側線，偶爾中帶多出一條線紋，寬5.6～ 8.8 μm。頭骨架強，骨化部分延伸至體部兩個環(huán)紋。口針粗壯，長18～19.2 μm，基部球大，圓球形，寬4～4.9 μm，高2.7～3.8 μm。食道腺覆蓋腸道的腹面，覆蓋長度為35.8～68.6 μm，排泄孔緊靠于半月體后，略后于食道腺與腸連接位置，至體前端距離為89.7～107.9 μm。卵母細胞單行排列，受精囊不清楚，卵巢長度為141.3～231.2 μm。后陰子宮囊短，長11.6～22.9 μm，小于最大體寬。陰門位置相對靠后，V值為83.9～87.9。尾圓柱形或亞圓柱形，末端寬圓或平，光滑，有時角質層增厚，側尾腺口位于尾中部，至尾末端距離為15.5～20.6 μm。

雄蟲：未發(fā)現。

寄主：地稔（Melastoma dodecandnun Lour.）。

經形態(tài)學特征和測量值比較，地稔根際的根腐線蟲（廣東種群SMDL和廣西種群GX630）與最短尾短體線蟲基本吻合，故將地稔根際的兩個短體線蟲種群均鑒定為最短尾短體線蟲[17]。

2.2 分子鑒定

廣東種群SMDL的LSU D2D3區(qū)和ITS序列長度為780 bp（圖2），與GenBank數據庫最短尾短體線蟲序列的一致性為97.2%～99.6%；ITS區(qū)序列長度為920 bp（圖2），與GenBank數據庫最短尾短體線蟲序列的一致性為93.7%～99.0%。廣西種群GX630的LSU D2D3區(qū)序列長度為780 bp，與GenBank數據庫最短尾短體線蟲序列的一致性為97.1%～99.9%；ITS區(qū)序列長度為919 bp，與GenBank數據庫最短尾短體線蟲序列的一致性為93.1%～99.8%。廣東種群SMDL和廣西種群GX630的LSU D2D3區(qū)序列一致性為98.8%，ITS序列一致性為98.9%。

分子序列分析結果表明，地稔根際的根腐線蟲（廣東種群SMDL和廣西種群GX630）均為最短尾短體線蟲。

2.3 系統發(fā)育分析結果

基于LSU rDNA D2D3和rDNA-ITS的短體線蟲系統發(fā)育樹（圖3，圖4）均顯示，本研究獲得的最短尾短體線蟲序列與已發(fā)表的同物種序列聚為高度支持的分支（PP=100），進一步證明本研究獲得的短體線蟲種群為最短尾短體線蟲。

3 討論

地稔作為一種地被植物，具有良好的園林觀賞應用價值，其藥用活性成分也有待開發(fā)，但人工栽培的地稔尚未有病蟲害發(fā)生相關報道[8]。本文首次報道了地稔根際線蟲類群，地稔是最短尾短體線蟲的新寄主，其對地稔的致病性有待進一步研究。

最短尾短體線蟲是11種重要短體線蟲之一，寄主植物種類豐富，嚴重影響植物的生長[3]。我國已有最短尾短體線蟲的報道[18-19]。地稔可生長在山坡地或者陽光照射到的林間和田間的酸性土壤中，生長迅速[4]，廣西種群GX630采自星光農場的荔枝果園，最短尾短體線蟲也危害荔枝[3]。因此，在一些能夠受到最短尾短體線蟲危害的農作物周圍，應該及時鏟除地稔，以阻止地稔攜帶的最短尾短體線蟲傳播。

短體線蟲種內ITS區(qū)變異較大[15-16]，一般情況下為1%～3%，部分種類達到6%～8%。例如：玻利維亞短體線蟲（P. bolivianus Corbett， 1983）、地中海短體線蟲（P. mediterraneus Corbett， 1983）和假咖啡短體線蟲（P. pseudocoffeae Mizukubo， 1992）為1%；扁豆短體線蟲（P. lentis Troccoli， De Luca， Handoo & Di Vito， 2008）為5%；桑尼短體線蟲（P. thornei Sher & Allen， 1953）和鈴蘭短體線蟲（P. convallariae Seinhorst， 1959）為6%；傷殘短體線蟲（P. vulnus Allen & Jensen， 1951）為6%[15]或7%[16]；落選短體線蟲[P. neglectus （Rensch， 1924） Filipjev & Schuurmans Stekhoven， 1941]和刻痕短體線蟲為 7%；穿刺短體線蟲[P. penetrans （Cobb， 1917） Filipjev & Schuurmans Stekhoven， 1941]、敏捷短體線蟲（P. agilis Thorne & Malek， 1968）和最短尾短體線蟲的ITS變異就達到8%[15] 。本研究中，廣東種群GX630的ITS區(qū)序列與GenBank數據庫最短尾短體線蟲序列的一致性為93.1%～99.8%，ITS區(qū)變異達到了6.9%，在最短尾短體線蟲種內ITS變異范圍之內。據報道，短體線蟲ITS區(qū)種內變異大的原因有兩個，一是短體線蟲ITS1和ITS2的堿基序列和長度變異大，二是短體線蟲的ITS序列是有記錄的植物線蟲中最短的[16]，在870～1 250 bp之間。堿基序列變異越大或者ITS序列越短，相對變異越大。而最短尾短體線蟲的ITS序列僅有920 bp，屬于較短ITS序列的短體線蟲。

參考文獻

[1] Potter J W， Olthof T A. Nematode pests of vegetable crops[M]// Evans E K， Trudgill D L， Webster J M. Plant parasitic nematodes in temperate agriculture. Wallingford： CAB International， 1993： 171-207.

[2] Lamondia J A. Interaction of Pratylenchus penetrans and Rhizoctonia fragariae in Strawberry Black Root Rot[J]. Journal of Nematology， 2003， 35（1）： 17-22.

[3] Castillo P， Vovlas N. Pratylenchus （Nematoda： Pratylenchidae）： diagnosis， biology， pathogenicity and management[M]. Leiden： Brill， 2007.

[4] 中國科學院植物研究所. 中國高等植物圖鑒： 第二冊[M]. 北京： 科學出版社， 1972.

[5] 國家中藥學管理局《中華本草》編委會. 中華本草： 精選本[M]. 上海： 上?？茖W技術出版社， 1998.

[6] 何桂芳， 夏宜平. 優(yōu)良野生觀花地被植物—地稔[J]. 北方園藝， 2005（3）： 39.

[7] 羅 連， 林石獅， 李成仁， 等. 鄉(xiāng)土地被植物地稔的規(guī)?；耘嗉夹g與景觀應用[J]. 江西農業(yè)， 2016（13）：84-85.

[8] 邱才飛， 錢銀飛， 陳華玲， 等. 地稔果的利用及高產栽培技術[J]. 中國農業(yè)信息（上半月）， 2012（2）： 34.

[9] 馮志新. 植物線蟲學[M]. 北京： 中國農業(yè)出版社， 2001.

[10] Mundo-Ocampo M， Troccoli A， Subbotin S A， et al. Synonymy of Afenestrata with Heterodera supported by phylogenetics with molecular and morphological characterisation of H. koreana comb. n. and H. orientalis comb. n.（Tylenchida： Heteroderidae）[J]. Nematology， 2008， 10（5）： 611-632.

[11] Wang H H， Zhuo K， Ye W M， et al. Morphological and molecular charaterisation of Pratylenchus parazeae n. sp.（Nematoda： Pratylenchidae） parasitizing sugarcane in China[J]. European Journal of Plant Pathology， 2015， 143（1）： 173-191.

[12] Subbotin S A， Sturhan D， Chizhov V N， et al. Phylogenetic analysis of Tylenchida Thorne， 1949 as inferred from D2 and D3 expansion fragments of the 28S rRNA gene sequences[J]. Nematology， 2006， 8（3）： 455-474.

[13] Vrain T C， Wakarchuk D A， Levesque A C， et al. Intraspecific rDNA restriction fragment length polymorphism in the Xiphinema americanum group[J]. Fundamental and Applied Nematology， 1992， 15（6）： 563-573.

[14] Subbotin S A， Ragsdale E J， Mullens T， et al. A phylogenetic framework for root lesion nematodes of the genus Pratylenchus （Nematoda）： Evidence from 18S and D2–D3 expansion segments of 28S ribosomal RNA genes and morphological characters[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution， 2008， 48（2）： 491-505.

[15] Waeyenberge L， Viaene N， Moens M. Species-specific duplex PCR for the detection of Pratylenchus penetrans[J]. Nematology， 2009， 11（6）： 847-857.

[16] De Luca F， Reyes A， Troccoli A， et al. Molecular variability and phylogenetic relationships among different species and populations of Pratylenchus （Nematoda： Pratylenchidae） as inferred from the analysis of the ITS rDNA[J]. European Journal of Plant Pathology， 2011， 130（3）： 415-426.

[17] Roman J， Hirschmann H. Morphology and morphometrics of six species of Pratylenchus[J]. Journal of Nematology， 1969， 1（4）： 363-386.

[18] 章淑玲， 王宏毅， 金 亮. 寄生臺灣春蘭的短體線蟲種類鑒定[J]. 熱帶作物學報， 2013， 34（12）： 2 463-2 466.

[19] 章淑玲， 廖琳琳， 劉國坤， 等. 花生短體線蟲病的病原鑒定與診斷[J]. 熱帶作物學報， 2015， 36（2）： 365-370.