相思樹(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及其細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

林秀蓮 葉玲娟 林玉玲 徐小萍 張梓浩 賴鐘雄

摘 要 試驗(yàn)分析了基因型、愈傷組織類(lèi)型、2，4-D濃度、蔗糖濃度，起始接種量等各因素對(duì)相思樹(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：選擇淡黃色，質(zhì)地鮮嫩松脆的愈傷組織作為相思樹(shù)懸浮培養(yǎng)的材料，能較快地建立起懸浮細(xì)胞系。黑木相思細(xì)胞小，胚性強(qiáng)，分散性好，最容易建立起懸浮細(xì)胞系。當(dāng)蔗糖濃度為30 g/L，2，4-D濃度為0.5 mg/L時(shí)，適宜于懸浮細(xì)胞的保持。起始接種量對(duì)相思懸浮細(xì)胞系生長(zhǎng)也有很大影響，從保持懸浮細(xì)胞系的角度看，每瓶25 mL培養(yǎng)基中適宜的接種量為0.5～1.0 g。臺(tái)灣相思懸浮細(xì)胞培養(yǎng)周期以7 d繼代1次，卷莢相思懸浮細(xì)胞培養(yǎng)周期以8～10 d為宜。同時(shí)，通過(guò)對(duì)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的顯微觀察可以看出不同基因型的相思樹(shù)懸浮細(xì)胞，其細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)各不相同。

關(guān)鍵詞 相思樹(shù)；懸浮細(xì)胞；細(xì)胞學(xué)觀察

中圖分類(lèi)號(hào) S687；Q813.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The effects of different genotypes， callus types， concentrations of 2，4-D， sucrose concentrations， and inoculation amount on the cell suspension culture were analyzed in the experiment. The results showed that the best initial material of the Acacia spp. for cell suspension culture was the fresh yellow， loose and soft callus II and Ⅲ， which were propitious to establish the suspension cell culture system quickly. In addition， the cells of the A. melanoxylon were small， of strong embryogenic characteristics and fine dispersion， which were easy to establish the cell suspension system. The cell suspension could be maintained well under the conditions that the sucrose concentration was 30 g/L and the 2，4-D concentration was 0.5 mg/L. And the initial inoculation amount also influenced the culture of cell suspension， of which the best inoculation amount was 0.5-1.0 g in 25 mL calli each bottle. The suitable subculture cycle of the cell suspension culture was 7 d in A. confusa， while 8-10 d in A. concinnata. By the histological observation， it showed that there were different cell growth in different genotypes.

Keywords Acacia spp.； cell suspension； histological observation

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.016

相思樹(shù)是中國(guó)引種的重要速生樹(shù)種，在中國(guó)南方短周期工業(yè)原料林發(fā)展、水土保持和豐富林木種質(zhì)資源等方面具有重要作用和地位[1]。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是植物細(xì)胞生長(zhǎng)的微生物化，由于其分散性好，細(xì)胞形狀及細(xì)胞團(tuán)大小大致相同，而且生長(zhǎng)迅速，重復(fù)性好，易于控制等有利因素[2]，因此被廣泛用于細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)、生理學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)的研究。懸浮單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)不僅可直接進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化、原生質(zhì)體分離、體細(xì)胞雜交等的研究，還可用于生產(chǎn)次生代謝物以及篩選細(xì)胞突變體等，因此懸浮細(xì)胞已經(jīng)成為植物生物技術(shù)中一個(gè)最有用的工具之一[3]。本實(shí)驗(yàn)室林珊珊[4]、姬明[5]分別對(duì)臺(tái)灣相思和黑木相思的懸浮細(xì)胞系的建立和保持做了研究，葉玲娟[6]研究了相思樹(shù)的細(xì)胞培養(yǎng)及其體胚發(fā)生，黃敬文等[7-8]利用黑荊樹(shù)懸浮細(xì)胞進(jìn)行低 溫馴化，Vengadesan等[9]建立了藤金合歡的懸浮細(xì)胞系并通過(guò)體胚發(fā)生方式獲得再生植株，Arumugam等[10]利用臺(tái)灣相思懸浮細(xì)胞系進(jìn)行了誘導(dǎo)子對(duì)抗氧劑誘導(dǎo)的影響，Hustache等[11]建立了阿拉伯膠樹(shù)的懸浮細(xì)胞系。同時(shí)，Gantait等[12]和Vengadesan等[13]對(duì)相思樹(shù)的組織培養(yǎng)與快繁應(yīng)用做了比較詳細(xì)的評(píng)述。

本文以臺(tái)灣相思（Acacia.confusa）、卷莢相思（A. concinnata）及黑木相思（A. melanoxylon）愈傷組織為材料，建立了相思樹(shù)的懸浮細(xì)胞系，比較了愈傷組織類(lèi)型、不同的2，4-D濃度、不同的蔗糖濃度、不同接種量對(duì)相思樹(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。并在此基礎(chǔ)上，研究了相思樹(shù)的懸浮細(xì)胞再生愈傷組織及其細(xì)胞學(xué)觀察，以期為相思樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞突變體篩選等提供優(yōu)良的試驗(yàn)體系，為苗木快繁、體胚誘導(dǎo)、原生質(zhì)體分離及有用次生物質(zhì)生產(chǎn)等方面的研究奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以臺(tái)灣相思、卷莢相思及黑木相思愈傷組織為材料[4]，由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 不同基因型相思樹(shù)懸浮細(xì)胞系的建立 選取繼代培養(yǎng)15 d，鮮重0.5 ～1.0 g，生長(zhǎng)旺盛、質(zhì)地松散的卷莢相思、臺(tái)灣相思及黑木相思愈傷組織，置于盛有液體培養(yǎng)基25 mL的三角瓶（150 mL）中，用鑷子夾碎，而后置于120 r/min的搖床上，在（25± 2） ℃、散射光條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，比較3種相思樹(shù)懸浮細(xì)胞系建立過(guò)程中懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

鮮重的測(cè)定：取細(xì)胞懸浮液，放在已知重量的尼龍網(wǎng)上過(guò)濾。過(guò)濾后用水沖洗，除去培養(yǎng)基，500 r/min下離心5 min，去除水分，稱(chēng)量后的重量，減去尼龍網(wǎng)（40 μm）重即為懸浮液細(xì)胞鮮重。測(cè)3次求平均值。

單細(xì)胞成活率：在載玻片滴一滴懸浮細(xì)胞，用0.4%的伊文思蘭染色，被染為藍(lán)色的為死細(xì)胞，不被染色的為活細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)一個(gè)視野下被染色的活細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)5個(gè)視野求平均值。

1.2.2 愈傷組織類(lèi)型對(duì)相思樹(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)系建立的影響 挑選3種相思樹(shù)不同類(lèi)型的愈傷組織于懸浮培養(yǎng)液中，分別比較臺(tái)灣相思白色松軟、綠色較硬、鮮黃色松脆的愈傷組織；卷莢相思白色松軟、淡黃色松脆的愈傷組織；黑木相思白色絮狀、白色松脆的愈傷組織對(duì)懸浮細(xì)胞系建立的影響。

1.2.3 不同的2，4-D水平對(duì)相思樹(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 將3種相思樹(shù)的愈傷組織0.5 g接到MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA的培養(yǎng)基中附加不同濃度的2，4-D的液體培養(yǎng)基中，2，4-D濃度梯度為：0.05、0.2、0.5、1、2、4 mg/L，統(tǒng)計(jì)2，4-D濃度對(duì)這3種不同品種相思樹(shù)懸浮細(xì)胞鮮重增長(zhǎng)量及單細(xì)胞生成率的影響。培養(yǎng)基配制如下：

X1：MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+0.05 mg/L 2，4-D

X2：MS+1 mg/L B A+0.5 mg/L NAA+0.2 mg/L 2，4-D

X3：MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 2，4-D

X4：MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+1 mg/L 2，4-D

X5：MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+2 mg/L 2，4-D

X6：MS+1 mg/L BA+0.5 mg/L NAA+4 mg/L 2，4-D

單細(xì)胞生成率的測(cè)定：取一滴培養(yǎng)7 d后含相思樹(shù)懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)液于載玻片上，在顯微鏡下觀察，測(cè)定不同角度的5個(gè)視野下單細(xì)胞所占的比率，測(cè)定3次，求平均值。

1.2.4 不同的蔗糖濃度對(duì)相思樹(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 選取已建立的細(xì)胞分散、生長(zhǎng)旺盛的懸浮細(xì)胞系，培養(yǎng)于下面6個(gè)培養(yǎng)基（表1），比較不同碳濃度對(duì)卷莢相思和臺(tái)灣相思懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的單細(xì)胞生成率的影響，以及對(duì)臺(tái)灣相思懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響。

1.2.5 不同接種量對(duì)相思樹(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響 分別挑取淡黃色、松散愈傷組織0.1、0.3、0.5、1.0、1.0、2.0、2.5 g于25 mL的液體培養(yǎng)基MS+ 2.0 mg/L BA+1.0 mg/L KT+0.5 mg/L 2，4-D，蔗糖30 g/L中。7 d后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。統(tǒng)計(jì)懸浮細(xì)胞達(dá)到最大密度所需的時(shí)間、細(xì)胞鮮重并計(jì)算其增長(zhǎng)率。增長(zhǎng)率=（培養(yǎng)7 d后細(xì)胞鮮重-初始接種量）/初始接種量×100%。測(cè)定3次，求平均值。

1.2.6 相思樹(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制 取來(lái)源相同的懸浮細(xì)胞分成9瓶進(jìn)行編號(hào)，每瓶取鮮重為0.5 g的愈傷組織，加入25 mL的液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)當(dāng)天開(kāi)始，每2 d測(cè)定其鮮重。

以上培養(yǎng)基中均添加蔗糖30 g/L，pH值均為5.8，并在1.1 kg/cm2 、121 ℃條件下滅菌20 min。

1.2.7 相思樹(shù)懸浮細(xì)胞系的再生 取繼代培養(yǎng)而得3種相思樹(shù)懸浮細(xì)胞系直接滴固體培養(yǎng)基上進(jìn)行平板培養(yǎng)，觀察懸浮細(xì)胞愈傷再生情況。

1.2.8 相思樹(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程細(xì)胞學(xué)觀察 取培養(yǎng)在液體懸浮培養(yǎng)基（培養(yǎng)基為30 g/L蔗糖，MS培養(yǎng)基中添加LH300 mg/L的無(wú)激素培養(yǎng)基，pH 5.8）中的懸浮細(xì)胞液，滴于載玻片上，放在倒置顯微鏡下觀察懸浮細(xì)胞分裂與發(fā)育情況，并顯微攝影記錄。

1.3 培養(yǎng)條件

懸浮細(xì)胞培養(yǎng)于HZQ-QX型全溫振蕩器中，轉(zhuǎn)速120 r/min，光照300 lx，12 h/d。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因型對(duì)相思樹(shù)細(xì)胞懸浮系建立的影響

不同基因型在建立穩(wěn)定懸浮系的過(guò)程中表現(xiàn)不同，其特征差異如表2所示。3種相思樹(shù)通過(guò)方差分析無(wú)顯著差異。卷莢相思細(xì)胞較大，10 d左右就能快速建立細(xì)胞分散性好，細(xì)胞團(tuán)由5～10個(gè)小細(xì)胞組成的懸浮細(xì)胞系（圖版I-A）。而臺(tái)灣相思的細(xì)胞較小，粘連性強(qiáng)，在繼代2周后才能建立起多由10～20個(gè)或5～10個(gè)小細(xì)胞組成的小細(xì)胞團(tuán)的懸浮細(xì)胞系（圖版I-C）。黑木相思愈傷組織的分散性最強(qiáng)，在懸浮培養(yǎng)液中，細(xì)胞立即分散開(kāi)，能建立良好的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液（圖版I-B）。通過(guò)對(duì)懸浮細(xì)胞特征的觀察還發(fā)現(xiàn)，黑木相思細(xì)胞分散性最好，形成的細(xì)胞懸浮液中，單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)個(gè)數(shù)最多，成活率也比較高，但懸浮細(xì)胞鮮重的增長(zhǎng)量最小。而臺(tái)灣相思和卷莢相思細(xì)胞懸浮液的各項(xiàng)指標(biāo)都差異不大。

2.2 不同類(lèi)型愈傷組織對(duì)相思樹(shù)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響

利用不同類(lèi)型的愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的結(jié)果表明，愈傷組織的形態(tài)類(lèi)型直接影響懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。對(duì)于臺(tái)灣相思3種形態(tài)的愈傷組織來(lái)說(shuō)，白色松軟的愈傷組織形成的懸浮細(xì)胞系，

細(xì)胞形態(tài)各異，內(nèi)含物少；而用綠色堅(jiān)硬的愈傷組織建立的懸浮細(xì)胞系可能由于纖維束分化過(guò)多，生長(zhǎng)緩慢且不易游離單細(xì)胞，難以建立懸浮細(xì)胞系。只有色澤鮮黃由致密小顆粒組成的愈傷組織，細(xì)胞松散，是臺(tái)灣相思細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的好材料。而卷莢相思的愈傷組織，白色松軟及淡黃松散的愈傷組織來(lái)說(shuō)，同臺(tái)灣相思類(lèi)似，淡黃松散的愈傷組織也是懸浮細(xì)胞系建立的最佳材料。同比黑木相思的愈傷組織，其細(xì)胞的分散性非常好，愈傷組織均能快速建立起懸浮細(xì)胞系。

2.3 2，4-D濃度對(duì)相思樹(shù)愈傷組織懸浮細(xì)胞系建立的影響

在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中，2，4-D起著十分重要的作用。將臺(tái)灣相思、卷莢相思、黑木相思3種穩(wěn)定懸浮系接種到附加不同濃度的2，4-D的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，3種懸浮細(xì)胞系表現(xiàn)出明顯的差異性。其結(jié)果如圖1和圖2所示：隨著2，4-D濃度的升高，懸浮細(xì)胞鮮重都呈先上升后下降趨勢(shì)。卷莢相思在2，4-D濃度為0.5 mg/L時(shí)細(xì)胞增殖倍數(shù)最大，隨后逐漸降低；當(dāng)濃度達(dá)到4 mg/L時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制，鏡檢發(fā)現(xiàn)空細(xì)胞增多。臺(tái)灣相思和黑木相思懸浮細(xì)胞增殖倍數(shù)則在2，4-D濃度為1.0 mg/L時(shí)最大，隨后降低。而相思樹(shù)懸浮單細(xì)胞的成活率則是隨著2，4-D濃度的升高而下降。因此，中低濃度的2，4-D水平有利于懸浮細(xì)胞系的保持和分化，過(guò)高2，4-D濃度不利于穩(wěn)定懸浮系的建立與保持。因此，本研究選擇0.5 mg/L的2，4-D濃度水平來(lái)保持相思懸浮系。

2.4 蔗糖濃度對(duì)相思樹(shù)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

糖類(lèi)是植物組織和細(xì)胞培養(yǎng)中必要的成分之一，一方面它是植物生長(zhǎng)提供所必需的營(yíng)養(yǎng)成分——碳源，另一方面它作為滲透穩(wěn)定劑維持細(xì)胞生長(zhǎng)。本文分別研究了蔗糖濃度為0、15、30、50、70、100 g/L對(duì)相思樹(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。其影響結(jié)果如圖3所示。

由圖3可看出，當(dāng)蔗糖濃度為30 g/L時(shí)，卷莢相思和臺(tái)灣相思分散最好，但隨著蔗糖濃度的上升，懸浮產(chǎn)生的單細(xì)胞所占的比率逐漸減小。蔗糖對(duì)卷莢相思懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的影響相對(duì)較大，當(dāng)蔗糖濃度達(dá)到30 g/L時(shí)，卷莢相思單細(xì)胞出現(xiàn)接近48%的分離率，而臺(tái)灣相思出現(xiàn)接近40%的分離率。

從表3可看出，蔗糖為30 g/L時(shí)最有利于臺(tái)灣相思細(xì)胞生長(zhǎng)，大部分細(xì)胞呈圓形，單細(xì)胞數(shù)目多，細(xì)胞碎片少，且細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，有利于懸浮細(xì)胞的保持。蔗糖濃度太高或太低，都容易造成細(xì)胞的褐化死亡，且細(xì)胞的碎片也增多，細(xì)胞多為長(zhǎng)條形。這可能是由于如果蔗糖濃度太低，則不足以提供細(xì)胞生長(zhǎng)足夠的養(yǎng)分，造成細(xì)胞的死亡；而如果蔗糖濃度太高，則使培養(yǎng)基形成一個(gè)高滲透壓的環(huán)境，不利于細(xì)胞對(duì)外界營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸取，從而導(dǎo)致細(xì)胞的衰亡。因此，選擇30 g/L的蔗糖濃度水平來(lái)保持相思懸浮細(xì)胞系。

2.5 細(xì)胞初始培養(yǎng)密度對(duì)相思樹(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

根據(jù)不同重量及不同品種的相思樹(shù)松散愈傷組織轉(zhuǎn)入懸浮培養(yǎng)液中，測(cè)定其達(dá)到最大密度所需時(shí)間、生長(zhǎng)量并計(jì)算其增殖率，其結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可看出，培養(yǎng)密度對(duì)相思樹(shù)懸浮細(xì)胞系生長(zhǎng)有很大影響，在每瓶25 mL的液體培養(yǎng)基中，當(dāng)每瓶接種愈傷組織量在0.3 g以上，懸浮細(xì)胞才能正常的繼代增殖；當(dāng)接種量小于0.3 g時(shí)，懸浮小細(xì)胞團(tuán)或單細(xì)胞很難再增殖。當(dāng)每瓶接種愈傷組織在0.3 g以上時(shí)，瓶中懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)量隨著接種量的增加而增加，達(dá)到最大密度所需的時(shí)間也隨之縮短，而增長(zhǎng)率卻隨之下降，這可能是由于在高密度下培養(yǎng)液中養(yǎng)分消耗殆盡的結(jié)果。從表4還可看出，黑木相思懸浮細(xì)胞達(dá)到最大密度所需的時(shí)間最長(zhǎng)，而其細(xì)胞生長(zhǎng)量最少；而卷莢相思懸浮細(xì)胞達(dá)到最大密度所需的時(shí)間最少，其細(xì)胞的生長(zhǎng)量最大。因此據(jù)表分析，卷莢相思和臺(tái)灣相思懸浮細(xì)胞因其生長(zhǎng)迅速，可以選擇每瓶的接種量在0.3 g；黑木相思懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞增殖率小，每瓶接種量可以為0.5 g來(lái)保持懸浮細(xì)胞系。如果為較快獲得懸浮細(xì)胞，可將接種量增加至1.5 g左右。

2.6 相思樹(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制

取來(lái)源相同的懸浮細(xì)胞，每瓶取鮮重為0.5 g的愈傷組織，加入25 mL液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從培養(yǎng)當(dāng)天開(kāi)始，每2 d測(cè)定鮮重，結(jié)果見(jiàn)圖4。

從圖4可以看出，臺(tái)灣相思、卷莢相思和黑木相思的懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)曲線具有相對(duì)一致性。細(xì)胞活躍生長(zhǎng)期在第4～8天，鮮重迅速增長(zhǎng)，細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的分裂能力。到第8天時(shí)，鮮重增加3～4倍；8 d后，培養(yǎng)物鮮重的增長(zhǎng)速度明顯下降，生長(zhǎng)緩慢。同時(shí)還可發(fā)現(xiàn)，同樣的接種量卷莢相思的懸浮細(xì)胞增長(zhǎng)速度明顯比臺(tái)灣相思和黑木相思快，黑木相思懸浮細(xì)胞的增殖量最小。而且卷莢相思和黑木相思懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的周期也比臺(tái)灣相思長(zhǎng)，在10 d后臺(tái)灣相思的懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)趨緩，卷莢相思和黑木相思的懸浮細(xì)胞系仍保持一定的增長(zhǎng)量。所以，臺(tái)灣相思懸浮細(xì)胞培養(yǎng)周期以7 d繼代一次比較合適。卷莢相思和黑木相思懸浮細(xì)胞培養(yǎng)周期以8～10 d為宜。

2.7 相思樹(shù)懸浮細(xì)胞再生能力測(cè)定

選取培養(yǎng)多代后的相思樹(shù)懸浮培養(yǎng)液5 mL滴于固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，5 d后有肉眼可見(jiàn)的臺(tái)灣相思和卷莢相思小愈傷團(tuán)出現(xiàn)，20 d后有大量的愈傷組織生成（圖版I-E、F、G），而黑木相思懸浮細(xì)胞再生速度較慢，10 d左右可見(jiàn)部分小愈傷團(tuán)，25 d左右才能見(jiàn)愈傷組織大部分長(zhǎng)成，生成愈傷組織的量也比臺(tái)灣相思和卷莢相思少，且有部分胚狀體的形成（圖版I-D、G）。這說(shuō)明經(jīng)過(guò)繼代多次的相思樹(shù)懸浮細(xì)胞系仍有很強(qiáng)的再生能力，但臺(tái)灣相思和卷莢相思懸浮細(xì)胞再生愈傷能力明顯比黑木相思強(qiáng)，這可能是由于黑木相思懸浮細(xì)胞較為分散，多由單細(xì)胞組成，但有一定胚狀體形成能力。而臺(tái)灣相思和卷莢相思懸浮細(xì)胞細(xì)胞團(tuán)含量多，因此再生速度比黑木相思快。

2.8 相思樹(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程的細(xì)胞學(xué)觀察

將接在液體懸浮培養(yǎng)基MS+BA 1 mg/L+ NAA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L中的相思樹(shù)懸浮細(xì)胞，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，3種相思樹(shù)細(xì)胞狀態(tài)各不相同（圖版I）：黑木相思在懸浮培養(yǎng)初期，懸浮培養(yǎng)中大部分為管狀細(xì)胞，少數(shù)為圓形胚性細(xì)胞，管狀細(xì)胞內(nèi)含物較少，含有較大的淀粉粒，不具有分裂能力，在懸浮培養(yǎng)過(guò)程中逐漸死亡（圖版I-G、H）。而圓球形的細(xì)胞內(nèi)含物豐富，具有較強(qiáng)分裂能力，在懸浮培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)多次細(xì)胞分裂形成許多活力較強(qiáng)的小細(xì)胞團(tuán)和球狀的單細(xì)胞。經(jīng)過(guò)3～4次繼代懸浮培養(yǎng)后，管狀細(xì)胞逐漸消失，被球狀的單細(xì)胞和小型不同所替代。而臺(tái)灣相思和卷莢相思細(xì)胞較大，培養(yǎng)初期細(xì)胞系主要由一些較大的細(xì)胞團(tuán)組成；由于外部的振蕩力及細(xì)胞本身的分散力，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞系中細(xì)胞團(tuán)變少，游離的單個(gè)細(xì)胞逐漸增多，這些單細(xì)胞個(gè)體較大，形狀有圓形、長(zhǎng)形和不規(guī)則形，細(xì)胞質(zhì)分布不均（圖版I-I、J）。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生分裂，由一個(gè)細(xì)胞來(lái)源的多細(xì)胞通常粘連在一起形成許多小的細(xì)胞團(tuán)（圖版I-K、L）。

3 討論

3.1 相思樹(shù)懸浮細(xì)胞系建立的關(guān)鍵因素

相思樹(shù)基因型和愈傷組織類(lèi)型的選擇，是建立懸浮細(xì)胞系的關(guān)鍵因素。相思樹(shù)基因型的不同，細(xì)胞大小不一致，對(duì)養(yǎng)分、外界環(huán)境的感應(yīng)不一致，使得懸浮培養(yǎng)在各方面均形成較大的差異。黑木相思細(xì)胞小，胚性強(qiáng)，分散性好，最容易建立起懸浮細(xì)胞系。卷莢相思由于其細(xì)胞相對(duì)較大，細(xì)胞的分散性好，粘連性低，在液體培養(yǎng)基的振蕩培養(yǎng)下，細(xì)胞結(jié)果2次懸浮繼代，就可以建立相對(duì)分散的懸浮細(xì)胞系。同時(shí)卷莢相思細(xì)胞內(nèi)含物相對(duì)臺(tái)灣相思少，細(xì)胞滲透壓底，在高濃度的蔗糖的影響下更容易導(dǎo)致細(xì)胞的褐化死亡等現(xiàn)象。

用于建立懸浮細(xì)胞系的愈傷組織要求分散性好、增殖快、再生能力強(qiáng)，一般來(lái)說(shuō)其外觀呈乳白色或淡黃色， 松散易碎[14-15]。鄧素芳等[16]、葉玲娟等[17]已經(jīng)在朱砂根與相思樹(shù)等研究表明，由外植體誘導(dǎo)來(lái)的愈傷組織往往有多種類(lèi)型， 選擇合適的愈傷組織類(lèi)型或?qū)⒁勋@得的愈傷組織進(jìn)行巧妙的繼代得到松散的胚性愈傷組織至關(guān)重要。本試驗(yàn)中選擇淡黃色、質(zhì)地鮮嫩松脆的愈傷組織作為相思樹(shù)懸浮培養(yǎng)的材料，在培養(yǎng)過(guò)程中，本研究也發(fā)現(xiàn)這些愈傷組織均能較快地建立起懸浮細(xì)胞系，同時(shí)，黑木相思愈傷組織還具有較強(qiáng)的胚性能力，因此在懸浮培養(yǎng)過(guò)程中就能發(fā)現(xiàn)綠色胚狀體的形成。而臺(tái)灣相思和卷莢相思愈傷組織經(jīng)過(guò)懸浮系的選擇后，均具有較強(qiáng)的增殖能力。

3.2 影響相思樹(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的主要因素

起始接種密度、蔗糖濃度及2，4-D濃度影響相思樹(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)。適宜的起始接種密度，可有效促進(jìn)細(xì)胞的增殖，保持細(xì)胞一定的長(zhǎng)勢(shì)，但隨著接種量的增加，細(xì)胞對(duì)養(yǎng)分的需求量也增大，在養(yǎng)分減少的同時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖能力也隨之下降。賴鐘雄等[18]、毛艷萍等[19]、蘇齊珍[20]、張?jiān)浦竦萚21]研究均發(fā)現(xiàn)適宜的接種密度利于懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，卷莢相思和臺(tái)灣相思懸浮細(xì)胞因其生長(zhǎng)迅速，可選擇每瓶的接種量為0.3 g；黑木相思懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞增殖率小，每瓶接種量以0.5 g來(lái)保持懸浮細(xì)胞系。如果為較快獲得懸浮細(xì)胞，可將接種量增加至1.5 g左右。

一定的蔗糖濃度有利于懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)，但是蔗糖濃度太高或太低都會(huì)降低懸浮培養(yǎng)中單細(xì)胞的分離率，這可能由于高滲透條件減緩了懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，促進(jìn)分化而使分散性降低，從而影響懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)質(zhì)量，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)含物的減少，細(xì)胞趨向死亡[18]。當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖濃度太低時(shí)，無(wú)法滿足提供細(xì)胞生長(zhǎng)的足夠的養(yǎng)分，造成細(xì)胞的死亡，而在高濃度的蔗糖環(huán)境會(huì)形成由于高滲透壓環(huán)境，抑制細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基中其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。這與姬明[5]、李紅等[22]、高晗等[23]、趙倩等[24]研究蔗糖對(duì)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)影響的觀點(diǎn)一致。本研究發(fā)現(xiàn)，30 g/L的蔗糖最有利于相思樹(shù)懸浮細(xì)胞狀態(tài)的保持。這與賴鐘雄等[18]研究龍眼懸浮細(xì)胞系中蔗糖對(duì)懸浮細(xì)胞系的保持是一致的。

2，4-D濃度對(duì)愈傷組織懸浮細(xì)胞的影響均較明顯。不同2，4-D濃度水平，細(xì)胞呈不同的狀態(tài)，過(guò)高濃度的2，4-D易導(dǎo)致懸浮細(xì)胞褐化、粘連，不利于建立穩(wěn)定分散的懸浮細(xì)胞系。適宜濃度的2，4-D濃度有利于懸浮細(xì)胞的增殖及胚性的保持。

3.3 不同種類(lèi)相思樹(shù)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化

不同種類(lèi)（基因型）的相思樹(shù)懸浮細(xì)胞，其細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)各不相同，通過(guò)懸浮細(xì)胞組織細(xì)胞學(xué)觀察，本研究可觀察到，黑木相思懸浮細(xì)胞大小各異，其含有的圓形細(xì)胞內(nèi)含物多且具有很強(qiáng)的分裂能力。而臺(tái)灣相思和卷莢相思懸浮系細(xì)胞多為圓形，但內(nèi)含物少，呈液泡狀，多為小團(tuán)狀。這就使得不同基因型相思懸浮細(xì)胞在培養(yǎng)后期分裂的能力和方向不同。黑木相思形成愈傷組織的能力比卷莢相思和臺(tái)灣相思弱，但黑木相思圓形懸浮細(xì)胞內(nèi)含物多，具有分化能力，能進(jìn)一步分化成胚狀體。

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