超低溫對(duì)降香種子遺傳變異和生理特性的影響

曾琳 顧雅坤 吳怡 魏建和

摘 要 采用單因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)方案探究降香種子玻璃化超低溫保存最適條件，結(jié)合顯微切片觀察和生理生化特性檢測(cè)對(duì)冷凍后細(xì)胞形態(tài)和生理生化指標(biāo)變化進(jìn)行分析，同時(shí)運(yùn)用形態(tài)觀察法和相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）分子標(biāo)記法對(duì)超低溫保存后的降香植株遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：降香種子玻璃化超低溫保存最佳條件為：室溫（25 ℃）裝載25 min，0 ℃ 玻璃化脫水30 min，40 ℃水浴解凍5 min。對(duì)比檢測(cè)不同冷凍時(shí)間的降香種子超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、α-淀粉酶、脫氫酶活性、丙二醛（MDA）含量以及電導(dǎo)率等生理生化指標(biāo)，無(wú)明顯差異。顯微觀察超低溫保存前后的降香種胚內(nèi)部結(jié)構(gòu)，未見(jiàn)明顯變化。超低溫保存后的降香種子發(fā)芽時(shí)，出現(xiàn)短暫的生長(zhǎng)停滯期，恢復(fù)培養(yǎng)后，其表觀形態(tài)指標(biāo)與對(duì)照植株無(wú)明顯差異。SRAP技術(shù)分析了超低溫冷凍前后的降香再生植株，其SRAP帶型基本一致，未見(jiàn)明顯差異帶型。綜上表明，超低溫保存降香種子是長(zhǎng)期穩(wěn)定、安全可靠的。

關(guān)鍵詞 超低溫保存；降香；遺傳變異；生理生化特性

中圖分類號(hào) R931.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In this study， we used a single factor random block test to optimize cryopreservation procedure of Dalbergia odorifera T. Chen seed by vitrification. The embryo cells of Dalbergia before and after frozen were inspected with microscope by paraffin section method， and the change of physiological and biochemical indexes of seeds before and after frozen were analyzed. In addition， the genetic stability of regenerated plantlets after cryopreservation was tested with sequence—related amplified polymorphism （SRAP） molecular marker method. The results showed that the optimal conditions for Dalbergia odorifera seeds vitrification were 25 min loading condition at room temperature， 30 min dehydration condition at 0 ℃ and 5 min thawing condition at 40 ℃. The was no significant difference in seed physiological and biochemical indexes of different freezing time， and when inspected by microscope before and after cryopreservation， the internal structure of the embryo had no obvious variations. These results suggest that the time of cryopreservation had no significant effect on germplasm preservation of Dalbergia odorifera. When sprouted the seed of Dalbergia odorifera after freeze in liquid nitrogen， there had a short period of stagnation， but the morphological indexes did not vary greatly with those of the control after renewal cultivation. No nucleotide sequence had been altered during cryopreservation， which was indicted by no obvious differences in the banding patterns of DNA fragments between survival material and the control material of the Genomic DNA analyzed by SRAP after cryopreservation. In conclusion， the ultarlow- temperature preservation of Dalbergia odorifera seeds was stable， safe and reliable.

Keywords cryopreservation； Dalbergia odorifera； genetic variation； physiological and biochemical traits

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.008

自1973年Nag等[1]首次成功地將液氮超低溫保存技術(shù)運(yùn)用在胡蘿卜懸浮培養(yǎng)細(xì)胞上以來(lái)，超低溫保存技術(shù)已成功保存了近300種植物材料[2]。大多數(shù)的植物材料在超低溫環(huán)境中，其細(xì)胞的新陳代謝活動(dòng)都會(huì)基本停止[3]，從而使細(xì)胞的活力和形態(tài)發(fā)生的能力能夠得到穩(wěn)定保存。液氮冷凍主要是對(duì)植物材料存活率和生理生化指標(biāo)有影響，從理論上講，經(jīng)過(guò)液氮處理后再生的植物材料不會(huì)發(fā)生遺傳變異[4-6]。但是植物材料在超低溫保存過(guò)程中，除液氮冷凍外，還涉及預(yù)培養(yǎng)、脫水、解凍和恢復(fù)培養(yǎng)等，這些過(guò)程會(huì)給植物材料造成脅迫，增加植物材料的氧化損傷[7]，傷害到植物細(xì)胞，從而影響植物材料的再生[8]，并可能對(duì)再生植株的遺傳穩(wěn)定性造成一定影響[9-10]。曾繼吾等[11]在用透射電鏡觀察番木瓜（Carica papaya L.）莖尖超低溫保存過(guò)程中細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞嚴(yán)重傷害主要發(fā)生在液氮冷凍和解凍過(guò)程。程志英[12]在觀察超低溫保存后的菊花（Dendranthema morifolium）莖尖組織結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，PVS2脫水對(duì)莖尖造成嚴(yán)重?fù)p傷，且液氮冷凍和解凍對(duì)莖尖組織細(xì)胞造成了不可逆的損傷。所以在對(duì)植物材料進(jìn)行超低溫長(zhǎng)期儲(chǔ)藏前，應(yīng)對(duì)超低溫冷凍的幾個(gè)步驟進(jìn)行優(yōu)化。

超低溫保存植物材料不止是為了獲得高存活率，也是為了得到安全、穩(wěn)定、保真的再生植株[11]，因此對(duì)超低溫儲(chǔ)藏后的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究是非常有必要的。植物材料表型特征評(píng)估可能是檢測(cè)超低溫儲(chǔ)藏對(duì)植株穩(wěn)定性影響的最簡(jiǎn)單的方法[6]。大部分研究表明，超低溫保存后的材料在形態(tài)學(xué)方面沒(méi)有明顯的變化[12]。在對(duì)超低溫保存后的山藥（Dioscorea opposite Thunb.）種質(zhì)[13]、橡膠（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）愈傷組織[14]、栓皮櫟（Quercus variabilis Blume）胚[15]的再生植株中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)形態(tài)變化，但超低溫處理后的杭菊（Chrysanthemum morifolium Ramat.t. Dulce.）[5]再生苗早期營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)指標(biāo)均低于對(duì)照。多數(shù)研究證明，超低溫保存前、后材料的基因組沒(méi)有發(fā)生遺傳穩(wěn)定變異[12]。在對(duì)超低溫保存前后的五葉草莓（Fragaria pentaphylla Losinsk.）[16]、留蘭香

（Mentha spicata Linn.）[17]、人參（Panax ginseng C. A. Mey）[2]、杭菊（Dendranthema morifolium （Ramat.） Tzvel.）[5]、君遷子（Diospyros lotus L.）[18]等植物種質(zhì)材料進(jìn)行基因組遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)時(shí)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因組改變現(xiàn)象；但在冷杉（Abies fabri （Mast.） Craib）、番木瓜等植物種質(zhì)材料中卻發(fā)現(xiàn)其基因組改變的現(xiàn)象[9]。

降香（Dalbergia odorifera T. Chen）是我國(guó)特有的瀕危藥用植物，其種子屬于頑拗性種子[19]，筆者所在實(shí)驗(yàn)室對(duì)降香的種子進(jìn)行了液氮超低溫保存，發(fā)現(xiàn)適宜含水量的種子超低溫保存后均能發(fā)芽，但部分芽不能健康地成苗。推測(cè)是因?yàn)橐旱蜏乇４孢^(guò)程中的一系列脅迫對(duì)降香種子造成了影響。本研究進(jìn)一步探究降香種子的超低溫保存最適條件，結(jié)合顯微切片觀察和生理生化特性檢測(cè)對(duì)超低溫冷凍后種子細(xì)胞形態(tài)和生理生化指標(biāo)變化進(jìn)行分析，并運(yùn)用序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）分子標(biāo)記技術(shù)從基因組遺傳穩(wěn)定性方面對(duì)超低溫保存前后的降香植株遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行分析，以期獲得穩(wěn)定、長(zhǎng)期保存降香種子的最優(yōu)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

將國(guó)家南藥基因資源庫(kù)提供的降香種子置于干燥器皿中，獲得含水量為12.5%～13.5%的種子實(shí)驗(yàn)材料，密封存于4 ℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 超低溫保存方法 對(duì)降香種子玻璃化冷凍步驟[19]進(jìn)行優(yōu)化：（1）室溫（25 ℃）裝載處理0～20 min；（2）0 ℃ PVS2玻璃化脫水處理0～ 90 min；（3）液氮冷凍0～7 d；（4）40 ℃水浴解凍30 s～10 min；（5）1.2 mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)液+純凈水洗滌；（6）恢復(fù)培養(yǎng)：將洗滌后的種子接種到含有0.3 mol/L蔗糖的1/2 MS培養(yǎng)基上，25～28 ℃條件下發(fā)芽培養(yǎng)。

1.2.2 遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

1）形態(tài)學(xué)觀察 定期觀察、記錄超低溫冷凍前后的降香種子發(fā)芽率，以及降香再生植株在葉形、葉色、株型和株高上與對(duì)照是否存在差異。

2）SRAP分析 采用TIANGEN DNAsecure Plant Kit提取降香再生植株總DNA，–20 ℃保存?zhèn)溆?。選用楊云等[20]篩選出的適合降香材料分析的25組SRAP引物，并參照其SRAP分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)程序?qū)迪阍偕仓赀M(jìn)行基因組遺傳穩(wěn)定性分析。

1.2.3 生理生化指標(biāo)檢測(cè) 取對(duì)照和液氮冷凍30 min、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d的種子各0.5 g，分別提取酶液，并測(cè)定以下指標(biāo)。采用3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS法）測(cè)定α-淀粉酶活性[21]，氯化三苯基四氮唑（TTC）法測(cè)定種子活力，氮藍(lán)四唑法（NBT法）檢測(cè)脫氫酶活性和超氧化物歧化酶（SOD）活性[22]，紫外分光光度法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）活性，愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性[23]，硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA）含量[24]，參照姜文[25]電導(dǎo)率測(cè)定方法測(cè)定降香種子電導(dǎo)率。

1.2.4 石蠟切片顯微觀察 取對(duì)照和液氮冷凍30 min、1 d、2 d、3 d、5 d、7 d的種子其種胚各12顆，進(jìn)行石蠟切片：FAA固定72 h，梯度酒精各脫水4 h，浸蠟2 h，埋蠟，Leica RM2245半自動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片，脫蠟，番紅、固綠溶液雙重染色處理，脫水處理，封膠制成永久切片，Nikon生物顯微鏡觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.3軟件中的ANOVA對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 降香種子玻璃化冷凍程序優(yōu)化

對(duì)降香種子玻璃化冷凍程序中的裝載、PVS2脫水以及解凍3個(gè)步驟進(jìn)行了單因子實(shí)驗(yàn)處理（圖1）。隨著裝載液處理時(shí)間的延長(zhǎng)，降香種子發(fā)芽率呈上升趨勢(shì)，但在處理25 min后趨于穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PVS2處理30 min時(shí)，降香種子的發(fā)芽率最高，處理時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)都不利于種子的發(fā)芽。隨著40 ℃水浴解凍時(shí)間的延長(zhǎng)，降香種子發(fā)芽率有所提高，5 min過(guò)后其發(fā)芽率急劇下降，這可能是因?yàn)闀r(shí)間過(guò)短，種子和冷凍保護(hù)劑還未完全解凍，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，種子吸水膨脹從而損害細(xì)胞。

綜上所述，降香種子玻璃化超低溫保存最適條件為：裝載處理25 min，PVS2處理30 min，40 ℃水浴解凍5 min。

2.2 液氮冷凍時(shí)間對(duì)降香種子存活率和理化性質(zhì)的影響

2.2.1 液氮冷凍時(shí)間對(duì)降香種子生活力的影響 隨著液氮冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)，降香種子生活力呈下降趨勢(shì)，但在冷凍3 d時(shí)出現(xiàn)上升，這可能是在液氮的刺激下，激發(fā)了種子細(xì)胞的防衛(wèi)反應(yīng)。降香種子生活力雖下降了，但仍在80%以上（圖2）。

2.2.2 液氮冷凍時(shí)間對(duì)降香種子生理生化特性的影響 如圖3所示，隨著冷凍時(shí)間的增加，降香種子生理生化指標(biāo)值均有所變化。其中，丙二醛含量隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)，其值上下浮動(dòng)，但變化不大，這說(shuō)明液氮冷凍對(duì)降香種子細(xì)胞膜脂過(guò)

氧化作用影響不大。相對(duì)電導(dǎo)率在冷凍3 d和5 d時(shí)其值上下波動(dòng)，但波動(dòng)幅度不大，最終與對(duì)照相差無(wú)幾，說(shuō)明液氮冷凍未對(duì)降香種子膜質(zhì)造成損傷。α-淀粉酶活性的變化呈下降、上升交替現(xiàn)象，最終趨于穩(wěn)定并高于對(duì)照，表明液氮冷凍促進(jìn)了可溶性糖的積累，提高了細(xì)胞的抗逆性。脫氫酶活性在冷凍1～2 d時(shí)急劇下降，但冷凍3 d后又上升至穩(wěn)定不變，說(shuō)明液氮冷凍改變了種子催化氧化還原酶的能力。過(guò)氧化氫酶活性在冷凍1 d時(shí)開(kāi)始下降，說(shuō)明種子活力下降了；在冷凍3 d時(shí)出現(xiàn)小幅上升，這可能是細(xì)胞出現(xiàn)的短暫性保衛(wèi)反應(yīng)；這結(jié)果與圖2結(jié)果一致。過(guò)氧化物酶活性在冷凍1 d時(shí)下降幅度較大，隨后又開(kāi)始上升并趨于平穩(wěn)，最終高于對(duì)照，這可能是液氮冷凍影響了活性氧清除系統(tǒng)的能力，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧、自由基的量變化不均。超氧化物歧化酶活性隨著冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)，緩慢上升，這表明在液氮冷凍刺激下種子清除自由基的能力增強(qiáng)了。

2.2.3 液氮冷凍時(shí)間對(duì)降香種胚組織的影響 對(duì)不同冷凍時(shí)間處理的降香種胚進(jìn)行石蠟切片顯微觀察，結(jié)果如圖4所示，對(duì)照組種胚細(xì)胞排布緊密、且細(xì)胞內(nèi)含物分布均勻；冷凍后的種胚細(xì)胞均出現(xiàn)輕微的質(zhì)壁分離，其中液氮冷凍30 min和3 d的種胚細(xì)胞質(zhì)壁分離最明顯，冷凍3、5、7 d的種胚出現(xiàn)少量空洞區(qū)域，而冷凍1、2 d的種胚細(xì)胞排布均勻緊密。總體而言，不同冷凍時(shí)間處理的種胚細(xì)胞結(jié)構(gòu)沒(méi)有出現(xiàn)較大的差異，這說(shuō)明冷凍時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)降香種胚細(xì)胞結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響。

2.3 超低溫保存后再生植株遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)分析

2.3.1 形態(tài)特征比較 對(duì)照種子接入培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d即可發(fā)芽，冷凍處理1 d的種子需3～5 d發(fā)芽。出芽后200 d，再生植株與對(duì)照植株在葉形、葉色、株型、株高上未見(jiàn)明顯差別（圖5）。

2.3.2 SRAP技術(shù)檢測(cè)基因組穩(wěn)定性 應(yīng)用SRAP技術(shù)對(duì)超低溫冷凍1 d后和對(duì)照組的降香種苗進(jìn)行檢測(cè)分析，25組引物均能擴(kuò)增出清晰的條帶，共擴(kuò)增出可統(tǒng)計(jì)條帶542條。每組引物對(duì)2個(gè)處理組樣品擴(kuò)增的多態(tài)性位置基本相同，部分條帶如圖5所示（從左至右其引物分別為：M8E7、M8E16、M9E11[20]），說(shuō)明對(duì)照與超低溫冷凍后的降香種苗之間基因組序列保持一致，未發(fā)生遺傳變異。

3 討論

本研究進(jìn)一步探究了降香種子玻璃化超低溫保存最適條件。研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)：裝載時(shí)間越長(zhǎng)降香種子活力越高，但在25 min后趨于穩(wěn)定，這是由于裝載液進(jìn)入種子細(xì)胞內(nèi)，增加了細(xì)胞內(nèi)的滲透壓同時(shí)也降低了冰點(diǎn)，起到了保護(hù)種子的作用；隨著PVS2處理時(shí)間的延長(zhǎng)，降香種子發(fā)芽率出現(xiàn)先上升后下降現(xiàn)象，這可能是由于處理時(shí)間過(guò)短導(dǎo)致的玻璃化不完全，從而導(dǎo)致種子在凍存過(guò)程中受到損傷，當(dāng)處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，冷凍保護(hù)劑二甲亞砜對(duì)種子的毒害作用導(dǎo)致了種子發(fā)芽率的下降。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，超低溫冷凍時(shí)間對(duì)超低溫保存降香種子的存活率并無(wú)顯著影響，這與Mony等[26]、朱文濤等[18]、郭強(qiáng)梨等[19]、李俊慧等[27]的研究相符。

植物組織在受到外界脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量自由基，使得膜脂過(guò)氧化生成MDA，MDA含量的增加導(dǎo)致細(xì)胞中離子大量外滲，從而導(dǎo)致植物組織相對(duì)電導(dǎo)率增加[28-29]。然而，植物組織中也有防御系統(tǒng)，SOD、POD、CAT和脫氫酶是植物組織重要的保護(hù)酶，可以減少或清除活性氧自由基，防止自由基對(duì)植物組織的毒害[30]。SOD可消除氧自由基產(chǎn)生過(guò)氧化氫，POD和CAT可分解過(guò)氧化氫為水，這正是植物體本身對(duì)外界脅迫在生理生化方面所做出的積極反應(yīng)[29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，超低溫保存后的降香種子MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率略有下降，而SOD、POD、CAT和脫氫酶活性均略高于冷凍前，即超低溫冷凍后降香種子內(nèi)膜過(guò)氧化能力稍有提高。這是由于液氮超低溫冷凍過(guò)程給植物組織制造了一個(gè)低溫脅迫環(huán)境，在這個(gè)環(huán)境中，植物組織體內(nèi)的SOD、POD酶活性會(huì)增強(qiáng)，以清除活性氧自由基，從而降低植物體內(nèi)的活性氧自由基和MDA含量，導(dǎo)致相對(duì)電導(dǎo)率降低[29， 31]。

對(duì)植物種質(zhì)資源保存來(lái)說(shuō)，不僅要保證物種的延續(xù)，而且也要盡可能確保其再生植株的遺傳穩(wěn)定性[32]。超低溫保存可以避免田間保存和繼代培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的遺傳變異和突變的風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)現(xiàn)植物種質(zhì)資源長(zhǎng)期、安全、穩(wěn)定保存[33]。本研究中，降香種子生活力隨著液氮冷凍時(shí)間的延長(zhǎng)，并未出現(xiàn)大幅度降低的現(xiàn)象，這保證了降香種質(zhì)的延續(xù)。在對(duì)降香再生植株表觀形態(tài)觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，超低溫冷凍后的降香種子與對(duì)照相比，恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)2～3 d的停滯期，可能是由于種子在超低溫保存過(guò)程中其生理狀態(tài)受到影響造成的。但培養(yǎng)一段時(shí)間后，冷凍處理組與對(duì)照組的生長(zhǎng)狀態(tài)表現(xiàn)一致，這保證了降香種質(zhì)再生植株的形態(tài)穩(wěn)定，與木茼蒿[34]、人參[2]、菊花[35]種質(zhì)資源超低溫保存后的結(jié)果一致。采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)超低溫保存后的降香再生植株進(jìn)行基因組遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)時(shí)，未檢測(cè)到遺傳變異，這確保了降香種質(zhì)的遺傳穩(wěn)定性。綜上所述，降香種子液氮超低溫保存技術(shù)是安全可靠的。

參考文獻(xiàn)

[1] 周權(quán)男， 孫愛(ài)花， 李 哲， 等. 木本植物超低溫冷凍保存研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2010， 26（6）： 93-96.

[2] 王 晗. 人參種質(zhì)資源超低溫保存方法及其對(duì)遺傳變異特性研究[D]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2016.

[3] 史鋒厚， 喻方圓， 沈永寶， 等. 超低溫貯藏對(duì)松油種子的影響[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2005， 29（6）： 119-122.

[4] 李曉丹. 百子蓮胚性愈傷組織玻璃化法超低溫保存技術(shù)的研究[D]. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué)， 2013.

[5] 高小霞. 杭菊超低溫保存再生植株生長(zhǎng)、遺傳穩(wěn)定性與內(nèi)含物評(píng)價(jià)及轉(zhuǎn)基因夏堇超低溫保存的研究[D]. 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2015.

[6] Byron Z， Inaudis C， Rene C， et al. Biochemical characterization of Ecuadorian wild Solanum lycopersicum Mill plants produced from non-cryopreserved and cryopreserved seeds[J]. CryoLetters， 2013， 34（4）： 413-421.

[7] Maria E， Carolina K， Miguel A， et al. Effect of antioxidants on the genetic stability of cryopreserved mint shoot tips by encapsulation-dehydration[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2016， 127（2）： 359-368.

[8] Carmen M， Carolina K， Ivan G， et al. Influence of the cryo-preservation technique， recovery medium and genotype on genetic stability of mint cryopreserved shoot tips[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2015， 122（1）： 185-195.

[9] 徐定華， 項(xiàng) 俊， 徐霞玲， 等. 超低溫保存技術(shù)在植物種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2007， 35（2）： 321-323.

[10] Nina R， Nahla V， Sugae W， et al. Genetic stability of cryo-preserved shoot tips of Rubus germplasm[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant， 2010， 46（3）： 246-256.

[11] 曾繼吾， 易干軍， 張秋明， 等. 番木瓜莖尖超低溫保存過(guò)程中的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)[J]. 園藝學(xué)報(bào)， 2005， 32（1）： 15-19.

[12] 程志英. 菊花莖尖超低溫處理過(guò)程中的相關(guān)生理生化與結(jié)構(gòu)變化[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2006.

[13] Keith H. Genetic integrity of cryopreserved plant cells： a review[J]. CryoLetters， 2004， 25（1）： 3-22.

[14] 王 晗， 雷秀娟， 宋 娟， 等. 藥用植物種植資源超低溫保存及遺傳變異特性研究進(jìn)展[J]. 特產(chǎn)研究， 2015（2）： 70-78.

[15] 趙喜亭， 王 苗， 邵換娟， 等. 山藥種質(zhì)包埋玻璃化超低溫保存再生植株的穩(wěn)定性分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2012，27（1）： 234-238.

[16] 倪燕妹. 橡膠樹(shù)易碎胚性愈傷組織誘導(dǎo)、長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)及其植株再生研究[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2010.

[17] 冀智清. 栓皮櫟胚性組織低溫保存及體胚遺傳穩(wěn)定性的研究[D]. 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2012.

[18] 朱文濤， 周厚成， 王子成. 五葉草莓超低溫保存及遺傳穩(wěn)定性分析[J]. 果樹(shù)學(xué)報(bào)， 2013， 30（1）： 55-61.

[19] 郭強(qiáng)梨， 李忠愛(ài)， 邵 麗， 等. 留蘭香莖尖超低溫保存及遺傳變異分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 41（5）： 128-132.

[20] 楊 云， 孟 慧， 吳 翼， 等. 降香黃檀SRAP分子標(biāo)記的引物篩選[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2011， 23（3）： 29-31.

[21] 王麗娜， 陳水鈁， 張 兵， 等. 3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定多糖含量的研究進(jìn)展[J]. 吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)， 2009， 30（4）： 232-234.

[22] 王學(xué)奎， 黃見(jiàn)良. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]. 北京： 高等教育出版社， 2015： 167-168.

[23] 張淑珍， 徐鵬飛， 吳俊江. 作物種子生理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京： 化學(xué)工業(yè)出版社， 2012： 75-76.

[24] 張慧茹. 生物化學(xué)試驗(yàn)原理和方法[M]. 銀川： 寧夏人民出版社， 1999： 59-63.

[25] 姜 文. 小麥種子活力及其與酶和貯藏蛋白關(guān)系的研究[D]. 合肥： 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2006.

[26] Mony R R， Suredra K M， Ravish C， et al. Storage behavior and cryopreservation studies in Indian rough lemon （Citrus jambhiri）： a promising rootstock for long-term conserva-tion[J]. Turkish Journal of Agriculture and Forestry， 2016， 40（6）： 865-873.

[27] 李俊慧， 何 平， 陳曉玲， 等. 香蕉離體莖尖超低溫保存研究[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2010， 11（1）： 34-39.

[28] 潘瑞熾. 植物生理學(xué)[M]. 北京： 高等教育出版社， 2004： 283-284.

[29] 宋萍萍. 懷菊花種質(zhì)資源玻璃化超低溫保存技術(shù)研究[D]. 新鄉(xiāng)： 河南師范大學(xué)， 2010.

[30] 錢紅格. 三種榆屬樹(shù)種種子萌發(fā)特性及活力變化的研究[D]. 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2009.

[31] 李萬(wàn)義. 桃葉衛(wèi)矛超低溫保存及其效果分析[D]. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué)， 2017.

[32] 邵 麗， 王子成. 植物種質(zhì)超低溫保存遺傳穩(wěn)定性的研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)通訊， 2010， 46（11）： 1 109-1 113.

[33] 韓 麗， 張金梅， 盧新雄， 等. 菊芋耐性脅迫及種質(zhì)保存研究進(jìn)展[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)， 2014， 15（5）： 999-1 005.

[34] 張知博. 木茼蒿莖尖超低溫保存與脫除菊花矮化類病毒的效應(yīng)與機(jī)理研究[D]. 楊凌： 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2015.

[35] 劉艷霞. 菊花莖尖超低溫保存及遺傳穩(wěn)定性評(píng)價(jià)[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2008.