瓜實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白基因的克隆及表達(dá)譜分析

張亞楠 龔治 牛黎明 符悅冠

摘 要 在氣味識(shí)別過程中，氣味結(jié)合蛋白（OBPs）對(duì)昆蟲的行為反應(yīng)有重要作用。通過轉(zhuǎn)錄組庫和NCBI篩選獲得瓜實(shí)蠅[Bactrocera cucurbitae（Coquillett）]OBPs基因序列，進(jìn)而通過RT-PCR、克隆等方法獲取cDNA全長序列，命名為BcucOBP19。結(jié)果表明：BcucOBP19基因開放閱讀框全長471 bp，編碼157個(gè)氨基酸，分子量17.5 ku，等電點(diǎn)5.14，具有昆蟲OBPs典型的6個(gè)保守半胱氨酸位點(diǎn)。BcucOBP19在瓜實(shí)蠅各部位均有表達(dá)，以15日齡的雌蟲觸角中表達(dá)量最高，在頭、腹、翅和前足中表達(dá)量較低，且沒有顯著性差異。

關(guān)鍵詞 瓜實(shí)蠅；氣味結(jié)合蛋白；基因克?。唤M織表達(dá)

中圖分類號(hào) S763.41 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract In the process of odor recognition， odorant binding proteins play an important role in the behavioral response to insects. The full-length cDNA sequence of Bactrocera cucurbitae （Coquillett） was identified by RT-PCR and cloned through transcriptome library and NCBI， which was named as BcucOBP19. The sequencing results showed that BcucOBP19 contained a 471 bp open reading frame encoding a 157-amino-acid residue peptide， The predicted molecular weight and isoelectric point was 17.5 ku and 5.14， respectively. The mature protein BcucOBP19 includeed six typical conservative cysteine residues， which is the hallmark of insect OBPs. BcucOBP19 was expressed in all parts of melon fruit fly. The expression of BcucOBP19 was the highest in the tentacles of 15 day-old females. The expressions were very low in the head， abdomen， wings and forefoot， which did not reach the significant level.

Key words Bactrocera cucuribitae； odorant binding protein； gene cloning； tissue expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.019

瓜實(shí)蠅[Bactrocera cucurbitae（Coquillett）]隸屬于雙翅目（Diptera）實(shí)蠅科（Tephritidae）果實(shí)蠅屬（Bactrocera macquart），是一種重要的檢疫害蟲[1]。瓜實(shí)蠅起源于印度[2]，現(xiàn)廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)[3]，主要為害葫蘆科植物，可為害南瓜、苦瓜、絲瓜等100多種蔬菜和水果[4]。

氣味感知涉及多個(gè)基因家族，包括氣味結(jié)合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）、化學(xué)感應(yīng)蛋白（CSPs）和氣味劑受體（ORs）等[5]。昆蟲OBPs是由嗅覺感器內(nèi)部支持細(xì)胞分泌的浸潤于感器淋巴液中并分布在感覺神經(jīng)元軸突周圍的一類水溶性酸性蛋白[6]，OBPs在昆蟲氣味分子和信息素識(shí)別、嗅覺信號(hào)傳導(dǎo)運(yùn)輸中具有重要作用[7]。昆蟲OBPs分子量一般為15～20 ku，由120～150個(gè)氨基酸組成，其典型特征是在其二級(jí)序列中存在6個(gè)保守的半胱氨酸（Cys）殘基以形成3對(duì)二硫鍵[8]，結(jié)構(gòu)緊湊，主要由K-螺旋域組成[9]。根據(jù)識(shí)別的氣味分子不同，OBPs又分為性信息素結(jié)合蛋白（pheromone binding protein，PBP）和普通氣味結(jié)合蛋白（general odorant binding protein，GOBP）[10]，前者與昆蟲感受性信息素有關(guān)，后者用于取食、信息交流等基礎(chǔ)活動(dòng)。

瓜實(shí)蠅雌蟲和雄蟲對(duì)一些氣味的趨向反應(yīng)不同，例如誘蠅酮只對(duì)雄蟲有吸引作用[11]，雌蟲對(duì)成熟瓜果的氣味趨向性更強(qiáng)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲對(duì)氣味的趨向行為與OBPs有關(guān)[12]，而OBPs基因只有少數(shù)被發(fā)現(xiàn)和克隆表達(dá)，這類基因的尋找是一大難點(diǎn)。在已經(jīng)進(jìn)行基因組全序列測(cè)定的昆蟲中，利用NCBI和轉(zhuǎn)錄組庫尋找近源種的OBPs基因序列，結(jié)合生物信息學(xué)以及熒光定量RT-PCR等生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)手段[13]，在昆蟲中鑒定OBPs基因。為了探究瓜實(shí)蠅OBPs在雌雄個(gè)體間表達(dá)是否存在差異，通過瓜實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組庫和NCBI搜尋氣味基因[14]，對(duì)瓜實(shí)蠅OBPs基因的一個(gè) cDNA全長序列進(jìn)行克隆和分析，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）測(cè)定瓜實(shí)蠅OBPs基因表達(dá)量。了解瓜實(shí)蠅OBPs的基本特征，有助于開發(fā)環(huán)境友好的新型昆蟲行為干擾劑。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)ハx為實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的瓜實(shí)蠅。飼養(yǎng)條件：溫度25 ℃，濕度60%～70%，光周期14L：10D。待其羽化后，收集不同日齡的雌雄瓜實(shí)蠅，活體采集各個(gè)部位。具體方法為：用角膜剪快速剪去各部位，置于在液氮環(huán)境中的1.5 mL離心管內(nèi)。瓜實(shí)蠅8日齡開始逐漸性成熟，15日齡進(jìn)入產(chǎn)卵高峰期。實(shí)驗(yàn)中分別收集2、5、8、15、30日齡雌性和雄性瓜實(shí)蠅的觸角、頭部（去觸角）、腹部、翅膀、前足共50個(gè)樣本，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：TransZol Up Plus Kit、TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、TransStart? Tip Green qPCR SuperMix、pEASY?-T1 Cloning Kit、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell等試劑盒來自北京全式金生物科技有限公司，Ampicillin、三氯甲烷、瓊脂糖、無水乙醇、Taq DNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker、DNA loading buffer等試劑均購自海南青峰科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的合成 采用TransZol Up Plus Kit推薦的方法提取RNA。提取的總RNA經(jīng)微量紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳（圖1）檢測(cè)濃度和質(zhì)量合格后，用TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA。反應(yīng)體系為20 ?L，包括10 ?L 2×TS Reaction Mix、1 ?L Anchored Oligo（dT）18 Primer（0.5 ?g/?L）、1 ?L gDNA Remover、1 ?L TransScript? RT/RI Enzyme Mix、50 ng～5 ?g RNA，Rnase-free Water 補(bǔ)齊至20 ?L。反應(yīng)條件：42 ℃ 30min，85 ℃ 5 s，4 ℃ ∞。cDNA產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 利用轉(zhuǎn)錄組庫設(shè)計(jì)得到克隆全長cDNA序列的引物和熒光定量PCR的特異性引物，并用已篩選出最穩(wěn)定的RPL-60作為熒光定量PCR的內(nèi)參引物（表1）。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2.3 瓜實(shí)蠅OBP19的克隆 以30日齡雌蟲的cDNA第一鏈為模板，用克隆引物進(jìn)行梯度PCR，電泳檢測(cè)出最適退火溫度。PCR反體系為20 ?L，包括10 ?L 2×EcoTaq PCR SuperMix ，上下游引物各1 μL，cDNA1 ?L，加ddH2O至20 ?L。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃，3 min；94 ℃ 45 s，退火溫度（51、54、57 ℃） 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min，；4 ℃，∞。將電泳鑒定無誤的PCR產(chǎn)物連接至T1載體，轉(zhuǎn)化入Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單個(gè)白色菌落溶于無菌水，PCR鑒定陽性克隆無誤后（圖2），在溶于無菌水的菌落中加入700 ?L LB液體培養(yǎng)基200 r/min 37 ℃培養(yǎng)8～10 h，菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)使用蛋白質(zhì)組學(xué)在線軟件 Expasy（http：//web.expasy.org/protparam/）分析，信號(hào)肽預(yù)測(cè)使用在線 軟 件 Signal P 3.0（http： //www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/）分析[14]。

1.2.4 瓜實(shí)蠅OBP19的時(shí)空表達(dá) 用試劑盒TransStart? Tip Green qPCR SuperMix推薦的方法進(jìn)行熒光定量。反應(yīng)采用熒光染料SYBR Green在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（QuantStudio 6 Flex）中用96孔板進(jìn)行。反應(yīng)體系共20 ?L，包括cDNA 1 ?L，引物F&R各0.4 ?L，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 ?L，Passive Peference Dye（50×） 0.4 ?L，ddH2O 7.8 ?L。反應(yīng)中ddH2O代替cDNA為陰性對(duì)照。反應(yīng)采用兩步法，具體程序設(shè)置如下：Step 1：94 ℃ 3 min；Step 2：94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 cycle；Step 3：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。信息采集步驟在Step 2 stage 2，60 ℃時(shí)信息采集。每個(gè)樣本的內(nèi)參組和OBP引物組分別重復(fù)3次，用無菌水代替cDNA做空白對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)CT值用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

使用SPSS19.0軟件對(duì)不同日齡瓜實(shí)蠅的不同部位RNA相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析、LSD檢驗(yàn)和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓜實(shí)蠅OBP19基因克隆及序列分析

以瓜實(shí)蠅30日齡的雌蟲為模板，以CL4828.aF和 CL4828.aR為引物，梯度PCR后將產(chǎn)物連接入T1載體克隆測(cè)序得到532 bp的DNA序列，通過DNAMAN軟件比對(duì)得到BcucOBP19基因開放閱讀框全長471 bp，編碼157個(gè)氨基酸（圖3）。BcucOBP19蛋白序列具有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，等電點(diǎn)為5.14，分子量大小為17.5 ku，不穩(wěn)定指數(shù)（instability index）為48.39，說明該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。脂肪指數(shù)（aliphatic index）為96.94，親和性（GRAVY）的平均水平為-0.152，說明其為親水蛋白質(zhì)，信號(hào)肽的位置在5端1～26位氨基酸中。

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）中尋找相似序列，用DNAMAN進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及蛋白序列比對(duì)（圖4），瓜實(shí)蠅BcucOBP19與南瓜實(shí)蠅（Zeugodacus tau GOBP19d-like）的氨基酸序列一致性高達(dá)94%，而與桔小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis OBP19d）和模式生物果蠅（Drosophila melanogaster OBP19d）的氨基酸序列一致性分別為73%和24%。實(shí)蠅科昆蟲的蛋白序列相似性很高，說明實(shí)蠅科OBP19可能在結(jié)構(gòu)和功能上相同。

2.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

將得到的蛋白序列輸入網(wǎng)站進(jìn)行分析，用http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？page=npsa_sopm.html進(jìn)行蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，跨膜結(jié)構(gòu)分析如圖5所示：在氨基酸序列中，α螺旋有85個(gè)氨基酸，占54.14%；β轉(zhuǎn)角有10個(gè)氨基酸，占6.37%；無規(guī)線圈有36個(gè)氨基酸，占22.93%；延長線有26個(gè)氨基酸，占16.56%；不存在β折疊、Pi螺旋等其他狀態(tài)。通過預(yù)測(cè)，跨膜結(jié)構(gòu)在6～24位氨基酸中，TM-螺旋長度為17～33。

蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)輸入SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）分析，結(jié)果如圖6所示，其主要結(jié)構(gòu)為6個(gè)α螺旋，無規(guī)線圈、延長線和β轉(zhuǎn)角少量存在。

2.3 聚類分析

把得到的BcucOBP19蛋白序列輸入NCBI （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）blast程序進(jìn)行同源性比對(duì)，相似序列包括實(shí)蠅科的南瓜實(shí)蠅、桔小實(shí)蠅、地中海實(shí)蠅、南美按實(shí)蠅、西印度按實(shí)蠅，以及果蠅科黑腹果蠅、非洲果蠅、中南美果蠅、西非果蠅的OBP19序列。用MEGA6.06軟件經(jīng)1 000次置信度構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。從圖7中可以看出，進(jìn)化樹分為兩支：實(shí)蠅科聚為一支（Group1），果蠅科聚為一支（Group2）。瓜實(shí)蠅和南瓜實(shí)蠅的OBPs序列最為相近，其次是桔小實(shí)蠅。瓜實(shí)蠅與果蠅科昆蟲的OBP19距離較遠(yuǎn)，這與昆蟲形態(tài)分類識(shí)別結(jié)果一致。

2.4 BcucOBP19表達(dá)譜分析

以2 d瓜實(shí)蠅雄蟲觸角中的表達(dá)量為對(duì)照，分別對(duì)2、5、8、15、30 d雌雄蟲不同部位（觸角、頭、腹、翅、前足）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）分析（圖8）。研究發(fā)現(xiàn)，BcucOBP19基因在瓜實(shí)蠅各部位均有表達(dá)：觸角中的表達(dá)量最高，前足中的表達(dá)量最低。在所有表達(dá)量中，15 d雌蟲的觸角表達(dá)量出現(xiàn)高峰，之后恢復(fù)到穩(wěn)定表達(dá)水平，其余各部位表達(dá)量沒有顯著性差異。

3 討論

昆蟲OBPs識(shí)別和結(jié)合外界氣味分子是昆蟲感受外界氣味分子的第一步生化反應(yīng)，對(duì)昆蟲與外界進(jìn)行信息交流具有重要意義[8]。本研究克隆了瓜實(shí)蠅的OBP19基因并獲得其cDNA序列，結(jié)果表明BcucOBP19基因具有實(shí)蠅科昆蟲OBP19序列的共同特征，即多肽鏈長157個(gè)氨基酸，相對(duì)分子質(zhì)量約為17.5 ku，信號(hào)肽的位置1～26位氨基酸，編碼親水性不穩(wěn)定蛋白，序列中有6個(gè)保守的半胱氨酸位點(diǎn)，具有昆蟲OBPs的典型特征[15-16]。為進(jìn)一步研究瓜實(shí)蠅的嗅覺功能提供了理論基礎(chǔ)。

昆蟲的OBPs主要在觸角中表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，不同日齡、不同組織表達(dá)譜中，BcucOBP19基因在瓜實(shí)蠅頭、腹、翅和前足都有少量表達(dá)，觸角中比其他部位總體表達(dá)量要高。15日齡的雌蟲觸角中出現(xiàn)大量表達(dá)，推測(cè)BcucOBP19基因在雌蟲性成熟發(fā)育、尋找寄主植物和產(chǎn)卵中擔(dān)任氣味識(shí)別的重要作用，BcucOBP19編碼的OBPs可能作為氣味劑和信息素的增溶劑或載體。NCBI上傳的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，很多昆蟲都有OBP19基因，例如桔小實(shí)蠅的BdorOBP19基因在雌性觸角中大量表達(dá)，在定位寄主植物和產(chǎn)卵過程中起重要作用[17]。關(guān)于BcucOBP19基因編碼的蛋白質(zhì)認(rèn)識(shí)不是很透徹，需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

了解昆蟲的OBPs的表達(dá)情況，可以作為分子靶標(biāo)對(duì)昆蟲進(jìn)行行為調(diào)控。后續(xù)可通過RNAi、基因敲除、基因沉默等方法檢測(cè)瓜實(shí)蠅在處理后表達(dá)量和行為上的變化，還可以用觸角電位儀檢測(cè)各種水果揮發(fā)氣味與BcucOBP19的結(jié)合程度，研究該基因的功能及化學(xué)感應(yīng)程度，從基因?qū)用媲袛嘈嵊X識(shí)別途徑和昆蟲氣味引誘防治害蟲，從而研制環(huán)境友好的新型害蟲行為調(diào)節(jié)劑。

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