子房注射法轉(zhuǎn)化‘紫寶石’蝴蝶蘭的研究

張莉 王佳 鄭楓 吳坤林 房林 李琳 曾宋君

摘 要 采用子房注射法對‘紫寶石蝴蝶蘭進(jìn)行外源DNA導(dǎo)入研究，結(jié)果表明：不同時期注射和不同注射處理方式對‘紫寶石蝴蝶蘭的落果率影響不同，對胚座組織和種子的GUS染色率的影響也不同，在授粉后65 d時，以2% DMSO為緩沖液，注射400 ?g/mL濃度質(zhì)粒，種子的GUS染色率最高達(dá)6.14%。選取各注射時期無菌播種后獲得的1 000個原球莖，經(jīng)系列濃度的潮霉素篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)授粉后65 d注射時獲得的抗性植株最多，為31株，轉(zhuǎn)化率為3.1%。切取轉(zhuǎn)化植株幼葉及幼根進(jìn)行GUS檢測，均為陽性；隨機(jī)挑選7株幼苗進(jìn)行PCR檢測，均能擴(kuò)增出GUS基因和HPT基因條帶，說明外源基因已經(jīng)整合到植株的基因組內(nèi)。此研究為蘭科植物育種提供了一種簡單高效的途徑。

關(guān)鍵詞 ‘紫寶石蝴蝶蘭；子房注射法；遺傳轉(zhuǎn)化；PCR

中圖分類號 S682 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The method of ovary injection was reported for Phalaenopsis ‘Purple Gem transformation in this study. Results showed that different injection treatments in different development stage of P. Purple Gem had different effect on the percentage of fertile fruit and GUS staining rate of seeds and placentas. The highest GUS staining rate of seeds from the mature fruit by ovary-injection was 6.14%. The highest 3.1% hygromycin-resistance plants were gained after hygromycin （Hyg） screening by a series of concentration in 65 DAP fruit. Seven plants selected randomLy were detected by GUS assay and PCR analysis of GUS and HPT， and all of them were positive. The results showed the integration and expression of foreign gene were integrated into hygromycin-resistance plants. The successful application of ovary injection for P. Purple Gem transformation could provide a simple and efficient method for the Orchidaceae breeding.

Key words Phalaenopsis ‘Purple Gem； ovary-injection； genetic transformation； PCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.009

蝴蝶蘭（Phalaenopsis）的花期長、花色豐富艷麗、花姿優(yōu)雅，是世界上產(chǎn)業(yè)化程度最高的蘭科觀賞植物[1]，蝴蝶蘭新品種培育主要依靠雜交育種[2-3]。但隨著蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，對其品種的新、奇、特等觀賞性狀和抗病、抗逆等農(nóng)藝性狀的要求越來越高，傳統(tǒng)的雜交育種等手段受其技術(shù)特點(diǎn)的限制，難以進(jìn)行定向育種，因此，包括轉(zhuǎn)基因技術(shù)在內(nèi)的分子育種越來越受重視[4]。蝴蝶蘭的轉(zhuǎn)基因研究可通過基因槍法[5]和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[6-10]來進(jìn)行，但由于蝴蝶蘭的遺傳轉(zhuǎn)化體系難以建立且轉(zhuǎn)化效率不高，因此研究進(jìn)展緩慢[11-12]?；ǚ酃芡ǖ婪ㄞD(zhuǎn)基因是一種操作簡單的遺傳轉(zhuǎn)化方法，已成功地應(yīng)用于小麥、水稻、玉米、大豆、棉花、煙草、油菜、甜菜、番茄、甜瓜、西瓜等植物中[13-14]，但在蘭科植物中僅有本實(shí)驗(yàn)室對石斛蘭（Dendrobium nobile）和五唇蘭（Doritis pulcherrima）的2例報(bào)道[15-16]。王佳等[15]在五唇蘭的子房注射法轉(zhuǎn)化的初步研究中證實(shí)，五唇蘭子房在注射外源DNA后，果實(shí)的生長會受到一定的影響，外源DNA進(jìn)入和整合到基因組的最佳時期為雙受精時。本研究以蝴蝶蘭雜交品種‘紫寶石（Phalaenopsis ‘Purple Gem）為材料，在明確其雙受精時間的基礎(chǔ)上，對其進(jìn)行子房注射法轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，以期為蝴蝶蘭的分子育種提供一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

受體材料為‘紫寶石蝴蝶蘭（Phalaenopsis ‘Purple Gem），種植于中國科學(xué)院華南植物園溫室大棚。供體為攜帶GUS基因和HPT基因的質(zhì)粒pCAMBIA1301。

1.2 方法

1.2.1 生長發(fā)育和花粉管生長觀察 ‘紫寶石蝴蝶蘭人工自花授粉后，掛牌記錄授粉時間。每隔5 d記錄果實(shí)長度和寬度的變化。

為確定‘紫寶石蝴蝶蘭授粉后的受精時間，從授粉后10 d開始，采集不同發(fā)育時期的子房（前50 d每隔5 d及50～70 d每隔2 d），用2%多聚甲醛+2.5%戊二醛+0.1 mol/L磷酸鈉固定24 h以上，苯胺蘭染色、制片，并于熒光顯微鏡下觀察花粉管通道的生長過程。

1.2.2 不同注射處理方式對果實(shí)發(fā)育的影響 采用3種不同的緩沖液[Tris-EDTA緩沖液（TE buffer，pH8.0；1/2 MS+5% sucrose+0.05% SilwetLet 77（細(xì)胞表面活性劑）；2%二甲基亞砜（DMSO）]對‘紫寶石蝴蝶蘭子房進(jìn)行注射，采用的質(zhì)粒濃度為400 ?g/mL，注射時間為65 d；以3種不同的質(zhì)粒濃度（200、300、400 ?g/mL）進(jìn)行注射時，采用的緩沖液為2% DMSO （F），注射時間為65 d。在5種不同的注射時間[50、60、65、70、75 DAP（day after pollination）]注射時，采用的緩沖液為2% DMSO （F），采用的質(zhì)粒濃度為400 ?g/mL。所有處理的注射量均為25 μL。每個注射時間處理36個果，每種緩沖液和質(zhì)粒濃度處理60個果，統(tǒng)計(jì)不同處理方式對落果的影響。

1.2.3 不同注射處理方式對胎座組織和種子GUS染色的影響 對1.2.2中所有處理獲得的果莢和對照的種子及胎座組織浸入適量的GUS染液中，于37 ℃暗處保溫12 h后，進(jìn)行無水乙醇脫色1～2 d觀察并拍照。統(tǒng)計(jì)不同處理方式對胎座組織和種子GUS染色率的影響。

1.2.4 無菌播種 參考王佳[15]對五唇蘭無菌播種的方法，采集‘紫寶石蝴蝶蘭授粉后200 d的成熟蒴果，采用相同的方法進(jìn)行消毒處理后，將1個果莢的種子制成10 mL的無菌水懸浮液播種于本實(shí)驗(yàn)室發(fā)明的N16固體培養(yǎng)基[花寶1號（Hyponex 1） 1 g/L + 花寶2號（Hyponex 2） 1 g/L + 蛋白凍（peptone） 2 g/L + 活性碳（activated carbon）1.5 g/L + B5培養(yǎng)基的維生素 + 萘乙酸（NAA）0.5 mg/L + 蔗糖（sucrose）20 g/L + 椰子汁（coconut milk） 100 mg/L + 瓊脂（agar）6.0 g/L ] [15，17]，放于溫度26～28 ℃、光照時間16 h/d和光照強(qiáng)度1 600～2 000 lx的培養(yǎng)室中進(jìn)行培養(yǎng)。每個果實(shí)播5瓶，每瓶2 mL。采用劃線法計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，每瓶約播種1 000粒種子。

1.2.5 選擇壓的確定和抗性植株的篩選 將未注射的對照材料萌發(fā)后60 d的原球莖接種到N16固體培養(yǎng)基（含潮霉素0、12.5、25、50、75、100 mg/L）上，每2周更換1次新的培養(yǎng)基，1個月后統(tǒng)計(jì)存活的原球莖數(shù)量，并確定最高選擇壓。

經(jīng)過上述試驗(yàn)后，將注射或未注射外源DNA的果莢的種子經(jīng)過60 d的萌發(fā)形成原球莖，各取1 000粒轉(zhuǎn)接至選擇培養(yǎng)基（含潮霉素50 mg/L）培養(yǎng)30 d，每個培養(yǎng)皿50個原球莖，然后將存活的原球莖轉(zhuǎn)接至選擇培養(yǎng)基（潮霉素濃度為75 mg/L）上繼續(xù)培養(yǎng)60 d，再將存活的原球莖在選擇培養(yǎng)基（潮霉素濃度為50 mg/L）上培養(yǎng)30 d，最后轉(zhuǎn)至N16培養(yǎng)基（無潮霉素）上培養(yǎng)60 d，經(jīng)過4輪篩選后計(jì)算存活率。

1.2.6 GUS組織化學(xué)檢測 將注射和對照的材料（包括胎座組織、種子、根和葉等）浸入適量GUS染液中，于37 ℃暗處保溫12 h后，用無水乙醇脫色1～2 d后，觀察并拍照。

1.2.7 抗性植株的PCR檢測 參考王佳[15]對五唇蘭的研究結(jié)果，對‘紫寶石蝴蝶蘭采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法分別提取抗性和對照植株基因組DNA，以pCAMBIA1301質(zhì)粒為陽性對照，非轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照。根據(jù)HPT基因設(shè)計(jì)的引物分別為：HPTL 5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'；HPTR 5'-GTGCTTGACATTGGGGAGT-3'，根據(jù)GUS基因設(shè)計(jì)的引物分別：GUSL 5'-GTGAATCCGCACCTCTGG-3'；GUSR 5'-ATCGCCGCTTTGGACATA-3'。20 μL反應(yīng)總體系：其中植物基因組DNA 1μL；PCRMix（2×） 10 μL；引物L(fēng) 1μL；引物R 1μL；Taq酶0.2 μL，補(bǔ)加水至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。產(chǎn)物經(jīng)w=0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘紫寶石蝴蝶蘭生長發(fā)育和花粉管生長觀察

‘紫寶石蝴蝶蘭在授粉后，子房才開始膨大發(fā)育，而未授粉成功的子房在3～5 d內(nèi)逐漸萎蔫脫落，因此，授粉是子房開始發(fā)育的必要條件。在授粉后5～65 d，蝴蝶蘭子房持續(xù)增粗增長；在授粉65 d后，子房的長度和寬度基本趨于穩(wěn)定，隨后只有少量的增長和變粗。最終子房平均長度為6.14 cm，平均寬度為1.28 cm，未注射果實(shí)中種子的平均數(shù)量為13 200粒。

通過顯微觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分果實(shí)從60 DAP開始出現(xiàn)有胚胚珠，部分胚囊發(fā)育趨于成熟；到65 DAP時，大量花粉管萌發(fā)生長至胚珠珠孔（圖1）。由此可推測，65 DAP左右可能是‘紫寶石蝴蝶蘭的雙受精時間。

2.2 不同注射處理方式對‘紫寶石蝴蝶蘭果實(shí)發(fā)育的影響

未經(jīng)注射處理的‘紫寶石蝴蝶蘭的果實(shí)不會落果。而在同一時期采用不同注射處理方式產(chǎn)生落果的比率有一定的差異。由表1～3可知，相比其他注射時間，授粉后65 d時，注射對子房發(fā)育影響較大，落果率達(dá)27.8%（表1）。在注射緩沖液類型的實(shí)驗(yàn)中，2% DMSO的落果率最高，為23.3%，遠(yuǎn)高于TE buffer的8.3%（表2）。在注射不同質(zhì)粒濃度的實(shí)驗(yàn)中，400 ?g/mL的落果率最高，為18.3%；而注射200 ?g/mL的質(zhì)粒濃度時，落果率為8.3%（表3）。

2.3 不同處理方式對‘紫寶石蝴蝶蘭胎座組織及種子GUS染色率的影響

采集180 DAP的‘紫寶石蝴蝶蘭成熟果莢，剖開后取胎座和種子進(jìn)行GUS染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射孔同圍的胎座組織和種子染色率較高。從表4～6可知，65 DAP為相對最佳的注射導(dǎo)入時間，胎座組織染色率最高可達(dá)27.8%，種子染色率為4.5%，且與其他注射時間相比具有顯著性差異。相對較佳的緩沖液類型為2% DMSO，胎座組織染色率為28.3%，種子染色率為2.98%。相對較佳的質(zhì)粒濃度為400 ?g/mL，胎座組織染色率為25.0%，種子染色率為3.02%。將這3種最佳處理方式的組合進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，即在65 DAP 時、以2% DMSO 為緩沖液注射400 ?g/mL濃度質(zhì)粒處理時，種子的GUS染色率最高，可達(dá)6.14%。

2.4 ‘紫寶石蝴蝶蘭無菌播種

經(jīng)子房注射處理后的‘紫寶石蝴蝶蘭果莢，僅對其果皮進(jìn)行消毒后，采用注射部位的種子培養(yǎng)時，100%的種子被污染，而未經(jīng)注射處理的對照中的種子基本無污染。在對子房注射處理后的果莢經(jīng)常規(guī)消毒后，再對種子進(jìn)行消毒后播種，材料污染情況可有一定程度的降低，但仍有20%～30%的種子染菌，而對照的果莢進(jìn)行同樣的消毒處理后，其染菌率同樣為0。

用本實(shí)驗(yàn)室發(fā)明的N16固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，對照果莢中的種子萌發(fā)率可達(dá)75.0%，顯著高于經(jīng)注射處理果實(shí)中的種子。而在65 DAP進(jìn)行子房注射處理果莢的種子，萌發(fā)率最低為40.78%，顯著低于其它注射時期，推測此時期進(jìn)行子房注射會最大程度地影響種子的發(fā)育（表7）。

2.5 ‘紫寶石蝴蝶蘭選擇壓的確定

‘紫寶石蝴蝶蘭原球莖接種4周后，在含0、12.5、25、50 mg/L Hyg的培養(yǎng)基上，原球莖能夠保持綠色；在含75 mg/L Hyg的培養(yǎng)基上，原球莖接種1周后開始出死亡，在2周后幾乎全部死亡，僅有少數(shù)原球莖呈淺黃綠色；在含超過100 mg/L Hyg的培養(yǎng)基上，原球莖全部死亡，特別是在篩選通過子房注射法獲得的種子萌發(fā)的原球莖時，同樣全部死亡（表8）。因此，確定75 mg/L Hyg為轉(zhuǎn)基因幼苗篩選的最高選擇壓。

2.6 ‘紫寶石蝴蝶蘭潮霉素篩選結(jié)果及抗性幼苗PCR鑒定

未經(jīng)子房質(zhì)粒注射處理的‘紫寶石蝴蝶蘭種子形成的原球莖，在附加50 mg/L潮霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，死亡率為82%，再w在附加75 mg/L潮霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，全部死亡；而經(jīng)過注射質(zhì)粒處理的原球莖在附加50 mg/L潮霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，死亡率約為30%；再在75 mg/L潮霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，約有20%的植株存活；再經(jīng)過75 mg/L和50 mg/L潮霉素2輪處理，結(jié)果見表9，其中在65 DAP注射時，得到的抗性原球莖最多，達(dá)31株，轉(zhuǎn)化率達(dá)3.1%，而在75 DAP注射時，轉(zhuǎn)化率僅為0.7%（表9）。

隨后在不含潮霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得的抗性植株均能成苗。隨機(jī)選取7個抗性幼苗，提取總DNA進(jìn)行PCR檢測，全部為陽性株，且選取抗性幼苗的幼根幼葉進(jìn)行GUS染色，所有材料均為GUS陽性，結(jié)果見圖2。

3 討論

大多數(shù)蘭科植物一個果莢中的種子數(shù)量繁多，利用花粉管通道法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化有較大的優(yōu)勢，因?yàn)榧词罐D(zhuǎn)化效率較低，也能獲得較多的轉(zhuǎn)化植株[15]。但由于大多數(shù)蘭花花朵完成受粉后，還需要1～3個月才能完成受精作用[12]，采用傳統(tǒng)的花粉管通道法易造成DNA降解，難以達(dá)到轉(zhuǎn)化的目的。采用子房注射法結(jié)合花粉管通道技術(shù)能有效地解決這個問題[15-16]，即當(dāng)蘭科植物在受精時，直接在子房中注射外源DNA，利用雙受精時卵細(xì)胞處于最佳感受態(tài)時，外源DNA易于進(jìn)入和整合的特點(diǎn)從而完成轉(zhuǎn)化，此技術(shù)已在五唇蘭（Doritis pulcherrima）上獲得了初步成功[15]。五唇蘭現(xiàn)已被歸并入蝴蝶蘭屬[18-19]，本研究采用的材料‘紫寶石蝴蝶蘭（Phalaenopsis ‘Purple Gem）是由五唇蘭為母本、小蘭嶼蝴蝶蘭（P. equestris）為父本雜交選育而來。唐源江等[20]研究五唇蘭在廣州地區(qū)栽培時的雙受精時間為受粉后45 d左右。而在本研究中，‘紫寶石蝴蝶蘭的雙受精時期為受粉后65 d左右，比五唇蘭晚。在‘紫寶石蝴蝶蘭的雙受精時期注射，也被證實(shí)了成功發(fā)育的果實(shí)具有較高的種子GUS染色率和遺傳轉(zhuǎn)化率，但在本研究中，此時期注射具有較高的落果率，主要原因可能是果實(shí)在雙受精時期注射外源DNA時更易受到傷害，但從遺傳轉(zhuǎn)化效果來看，65 d時進(jìn)行子房注射仍是最佳的注射時間。另外，在對‘紫寶石蝴蝶蘭胎座組織進(jìn)行GUS染色檢測時，發(fā)現(xiàn)未注射果實(shí)的胎座組織不能染色，而處理過的果實(shí)的胎座組織出現(xiàn)不同比例的染色，推測胎座組織在受精過程或者種子發(fā)育的某段時間也處于較高的活性狀態(tài)，能將外源DNA整合到其中，也可能是種子吸收外源DNA的通道。

植物的雜交種具有雜種優(yōu)勢，本研究中采用的‘紫寶石蝴蝶蘭的種子萌發(fā)率比五唇蘭高。本實(shí)驗(yàn)室中對照種子在N16號固體培養(yǎng)基上萌發(fā)率可達(dá)75.0%，通過子房注射處理的種子萌發(fā)率為52.5%，而五唇蘭的種子萌發(fā)率分別為66.11%、21.85%。特別是在進(jìn)行潮霉素篩選時，五唇蘭適合的潮霉素濃度為30 mg/L→40 mg/L→50 mg/L→無潮霉素的培養(yǎng)基上成苗，而‘紫寶石蝴蝶蘭在此濃度下進(jìn)行篩選，大部分原球莖不死亡，通過研究發(fā)現(xiàn)其適合的潮霉素濃度為50 mg/L→75 mg/L→75 mg/L→50 mg/L→無潮霉素的培養(yǎng)基上成苗，轉(zhuǎn)化率達(dá)3.1%，比五唇蘭（1.8%）高。

通過對隨機(jī)選取的‘紫寶石蝴蝶蘭7個抗性植株進(jìn)行PCR檢測，GUS基因和潮霉素抗性基因均呈陽性，說明外源基因可能整合到了基因組內(nèi)，至于是否能穩(wěn)定遺傳，還需要對試驗(yàn)植株的下一代進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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