稻瘟病菌類LxAR家族基因的預測及表達分析

韓藝娟　鐘振暉　吳劍英　魯國東　王宗華

摘 要 在侵染水稻過程中，稻瘟病菌分泌一系列效應因子來抑制寄主免疫系統(tǒng)。無毒效應因子AVR Pii和AvrPiz-t的氨基酸序列含有類LxAR基序，基于此，本研究利用生物信息學技術，從稻瘟病菌基因組中篩選獲得了99個含有類LxAR基序的假定效應因子（MoLLEs）。該家族蛋白都為小分子蛋白（70～300 aa），富含半胱氨酸氨基，絕大多數(shù)為未知功能的蛋白。24個蛋白含已知的功能域，可能涉及了多種生命過程，其中有9個蛋白編碼植物細胞壁降解酶。通過表達模式分析發(fā)現(xiàn)，MoLLEs家族基因成員的表達受到饑餓脅迫、附著胞生長發(fā)育以及侵染水稻等過程的誘導，此外一部分基因受到附著胞發(fā)育關鍵基因PMK1調(diào)控?；虮磉_交叉分析表明，部分基因同時在附著胞發(fā)育和致病過程中上調(diào)表達。在與水稻的相互作用中，MoLLEs在稻瘟病菌侵染不同階段均有上調(diào)表達，并且部分基因受親和或非親和反應特異性誘導。

關鍵詞 稻瘟病菌；LxAR效應分子；生物信息學預測；附著胞；侵染；RNA-seq

中圖分類號 S435.111.4+1 文獻標識碼 A

Abstract Rice blast fungus Magaporthe oryzae secrets effector proteins to suppress host immunity when infecting with rice. AVR Pii and AvrPiz-t， M. oryzae avirulence effectors， both contain LxAR motif， which leads us to predict and get 99 of LxAR like effectors （MoLLEs） from M. oryzae genome using bioinfomatics tools in this study. MoLLEs are rich in cysteine and encoded as small amount proteins by ranging from 70 to 300 amino acid residues. Most of the members in this family are hypothetical proteins and only 24 are annotated with domain information which may be involved in many life processes. Nine MoLLEs proteins are predicted as plant cell degraded enzymes. We analyzed the expression patterns of MoLLEs genes and found quite a number were upregulated upon nutrient limitations and appressorium development. In addition， MoLLEs genes were induced during infections with rice. Some MoLLEs genes were specifically up-regulated by compatible or incompatible interaction.

Key words Magnaporthe oryzae； MoLLEs effector； bioinformatic prediction； appressorium； infection； RNA-seq

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.023

在與病原菌的長期互作中，植物不斷進化出一系列免疫機制來防御外界侵襲。目前為止，植物體存在2個層次的先天免疫系統(tǒng)，即病原相關分子模式（pathogen associated molecular pattern， PAMP）觸發(fā)的免疫反應（PAMP-triggered immunity， PTI）和效應因子觸發(fā)的免疫反應（effector-triggered immunity， ETI）[1-2]。PAMP是一類結構保守的小分子物質(zhì)，如真菌幾丁質(zhì)、細菌鞭毛短肽flg22等，被細胞膜受體識別后，可誘發(fā)植物細胞氧爆發(fā)、胼胝質(zhì)積累、防御基因表達等[3-6]。ETI是基于病原菌效應因子的高級免疫反應，符合基因-基因假說。植物中的R基因可直接或間接識別病菌中的無毒基因（Avr），激發(fā)更加強烈的過敏反應，使植物呈現(xiàn)抗病表型[1-2]。

為克服植物免疫反應，在侵染初期，病原菌通過分泌一些效應因子來干擾寄主受體的識別，致使植物感病，該過程稱為效應因子觸發(fā)的感病反應（effector triggered susceptible reaction， ETS）[1-2， 7-9]。細菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type III secretion system， T3SS）是目前研究得最清楚的ETS系統(tǒng)。病原細菌可借助T3SS將效應因子轉運進植物細胞內(nèi)，來破壞寄主免疫反應[10]。丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000）無毒效應因子AvrPto或AvrPtoB均可抑制番茄（不攜帶Pto基因）細胞程序性死亡，致使番茄感病。當細菌AvrPto或AvrPtoB被抗病番茄（攜帶Pto基因）識別時，寄主體內(nèi)則產(chǎn)生細胞程序性死亡，表現(xiàn)出抗病的表型[11]。

相比細菌，大部分病原卵菌或真菌并沒有TTSS，而是通過其特有的吸器或其他結構將效應因子運輸?shù)街参锛毎麅?nèi)。卵菌效應因子N端基序RXLR（Arg-X-Leu-Arg，X為任意氨基酸）廣泛存在疫霉屬和霜霉屬無毒效應因子中，這為無毒效應因子的鑒定提供了有力的遺傳支持[12-14]。RxLR基序為部分卵菌效應因子識別植物細胞的一種定位信號。馬鈴薯疫霉（Phytophthora infestans）AVR3a和大豆疫霉（Phytophthora sojae）AVR1b的RxLR基序均可結合寄主植物細胞膜PI3P蛋白，進而將效應因子轉運進植物細胞[14-15]。大部分卵菌RxLR效應因子可破壞寄主免疫力，主要表現(xiàn)為對細胞程序性死亡、防御基因轉錄等的抑制[14-15]。某些核心效應因子（如霜霉HaRxL23和大豆疫霉PsAvh73）還可抑制多種植物的防御反應[16]。在真菌稻瘟病菌中，效應因子通過Biotropic Interfacial Complex （BIC）結構進入水稻細胞（如效應因子PWL2和AvrPiz-t），或停留在Extrainvasive Hyphal Membrane （EIHM）作為質(zhì)外體蛋白行使功能（如效應因子BAS4和Slp1）[17-21]。迄今為止，稻瘟病菌40多個無毒基因得到鑒定[22-23]，其中PWL2、AvrPita、Avr-CO39、AvrPiz-t、AVR-Pii、Avr-Pia、AVR-Pik/km/kp[24]、ACE1[25]、AVR-Pikm[26]、AvrPi9[27]和AvrPib[28]等基因已被克隆。這些無毒效應因子序列多樣性強、保守性較低，這給效應因子的預測增加了難度。盡管如此，但是AVR-Pii和AvrPiz-t序列編碼了類似卵菌的RxLR基序，即LxAR（Leu-x-Ala-Arg，x為任意氨基酸））或是類LxAR基序[23，29]。除此之外，有報道預測稻瘟病菌基因組可能還編碼一些含有LxAR基序的蛋白[23]，然而該部分基因的功能尚未有報道。

由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是水稻的主要病害。該菌還可侵染其他禾本科植物，嚴重威脅了糧食生產(chǎn)，因此研究其致病機理迫在眉睫。稻瘟病菌與寄主水稻的基因組已全部測序，加上易于進行基因操作和遺傳分析，二者之間的互作機制逐漸成為病原菌與植物互作的主要模型之一[30-34]。本研究利用生物信息學技術獲得了99個具有LxAR基序的假定效應因子（LxAR like effectors， LLEs），并對蛋白大小和結構域等進行分析，結合稻瘟病菌侵染階段轉錄組數(shù)據(jù)，分析MoLLEs基因的表達模式，以期為進一步研究這些基因的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試稻瘟病菌的菌株為Guy11，將Guy11營養(yǎng)菌絲接種到酵母淀粉培養(yǎng)基（酵母粉2 g/L、蔗糖3 g/L、可溶性淀粉10 g/L、瓊脂粉18 g/L）后置于26 ℃溫度下生長；后將擴繁的菌絲體轉接到產(chǎn)孢培養(yǎng)基（米糠40 g/L、瓊脂粉18 g/L，pH 6.0），26 ℃光照培養(yǎng)[35]。

供試水稻品種為Pid3和TP309。對長至三葉一芯期的水稻進行稻瘟病菌接種后置于25 ℃環(huán)境保濕。

1.2 方法

1.2.1 稻瘟病菌MoLLEs家族蛋白的檢索和鑒定 從稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫（http：//fungi.ensembl.org/Magnaporthe_oryzae/）下載全基因組蛋白序列，以SignalP 4.1 程序（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽預測與分析[36]。利用MEME motif search（http：//meme-suite.org/）[37]獲得含有LxAR基序的99個蛋白。利用NCBI Conserved Domains在線軟件（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi？）[38]預測蛋白結構域。

1.2.2 稻瘟病菌MoLLEs家族蛋白系統(tǒng)演化分析 利用MAFTT （Multiple Alignment using Fast Fourier Transform）[39]對MoLLEs序列進行序列多重比對，后用FastTree構建maximum-likelihood進化樹，所選模式為JTT+CAT[40-41]。再用itol在線軟件對所得進化樹進行編輯（http：//itol.embl.de/#）。利用PRALINE（http：//www.ibi.vu.nl/programs/pralinewww/）對MGG_10780、MGG_15371、MGG_14965、MGG_16489氨基酸序列進行比對分析多重比對。

1.2.3 稻瘟病菌MoLLEs家族基因表達模式 將稻瘟病菌Guy11孢子懸浮液分別接種水稻Pid3、TP309，并在接種24、36 h后取發(fā)病水稻樣品，以營養(yǎng)菌絲為對照，分別提取總RNA，進行轉錄組測序。通過Tophat、Cufflinks、Cuffmerge法從獲取的reads中提取外顯子[42]。通過RSEM（RNA-Seq by Expectation-Maximization）法計算基因表達豐度[43]，并以RPKM的形式，用R package Pheatmap繪制基因表達熱圖。為研究MoLLEs家族基因的潛在功能，本研究結合HT-SuperSAGE在線數(shù)據(jù)[44]（http：//cogeme.ex.ac.uk/supersage/），對MoLLEs家族基因在稻瘟病菌不同生長階段下的轉錄表達情況進行分析。

2 結果與分析

2.1 稻瘟病菌假定MoLLEs分泌蛋白序列的獲得和性質(zhì)分析

在前期研究中，本課題組預測了1 701個假定稻瘟病菌分泌蛋白[45]。在此基礎上，本研究篩選并獲得了99個含有類LxAR基序的效應因子，即MoLLEs（圖1-A）。氨基酸長度分布分析顯示，MoLLEs蛋白主要分布在100～250個氨基酸殘基（aa）之間，其中，201～250 aa區(qū)間占28.3%，151～200 aa占22.2%，101～150 aa占21.2%，而小分子蛋白（<100 aa）占16.2%，251～300 aa占12.1%（圖1-B），可見MoLLEs蛋白的序列符合稻瘟病菌效應因子小分子量的特點。已知無毒基因常含有多個半胱氨酸（Cys）殘基，其組成的二硫鍵對效應因子的功能起重要作用。對MoLLEs蛋白半胱氨酸組成進行了統(tǒng)計分析（圖1-C），結果顯示：37% MoLLEs含有1～3個Cys殘基；33%蛋白有4～6個Cys殘基；16%蛋白含有7～12個Cys殘基，其中3%的蛋白（MGG_00305、MGG_07900、MGG_10102）有10個Cys殘基，2%的蛋白（MGG_05831、MGG_10557）有12個Cys殘基。

對稻瘟病菌99個假定MoLLEs蛋白的功能域分析發(fā)現(xiàn)，僅有24個蛋白可預測到相關結構域信息，其余75個MoLLEs蛋白均為未知功能（表1）。9個已知功能域的蛋白可能參與降解植物細胞壁過程，如角質(zhì)酶（MGG_02393、MGG_05798、MGG_09100）、β-1，4-木聚糖內(nèi)切酶（MGG_08424、MGG_08331）、纖維二糖脫氫酶（MGG_00074）和果膠酯酶（MGG_14572）。其他MoLLEs蛋白參與的代謝途徑比較廣泛，例如糖代謝（MGG_17464）、脂肪代謝（MGG_08624、MGG_09333）、氨基酸代謝（MGG_02508）、DNA修復（MGG_16238、MGG_16551、MGG_13256）。MGG_00305的CVNH結構域來源于病毒外殼蛋白；MGG_08454編碼類似疫霉NPP1（necrosis inducing protein）結構域，這兩個蛋白可能與誘導細胞死亡相關。

2.2 稻瘟病菌假定MoLLEs家族蛋白序列進化分析

為更好了解MoLLEs家族蛋白與已知稻瘟病菌無毒蛋白之間的進化關系，對MoLLEs、AvrPiz-t、AVR Pii的氨基酸序列構建了進化樹（圖2-A）。根據(jù)演化特征，該進化樹可分為6個分支（Clade1～Clade6）。 Clade1涵蓋了植物細胞壁降解酶、甾醇C-8異構酶和酪氨酸酶等蛋白，其中4個未知蛋白（MGG_10780、MGG_15371、MGG_14965、MGG_16489）在進化上相對保守。對其進行多重序列比對分析，發(fā)現(xiàn)這4個蛋白之間同源較強（圖2-B），說明該家族基因在進化過程中出現(xiàn)部分基因復制事件。在Clade2～Clade6中，MoLLEs蛋白序列呈現(xiàn)明顯的趨散性，體現(xiàn)了該家族蛋白的多樣性。然而Clade6也出現(xiàn)了一些與已知無毒效應因子同源性較接近的蛋白，MGG_17695、MGG_11397與AvrPiz-t的boottrap值在80%以上，MGG_17248、MGG_10556與AVR Pii較為靠近，boottrap值大于70%。

2.3 稻瘟病菌MoLLEs家族基因在生長發(fā)育階段的表達模式

在99個MoLLEs中，39個MoLLEs基因無轉錄信息，60個MoLLEs受不同程度的誘導。在營養(yǎng)菌絲階段，19個MoLLEs基因受到饑餓上調(diào)（以1.5倍為閾值）。在附著胞發(fā)育過程中，21個MoLLEs基因在附著胞形成早期（4～8 h）表達上調(diào)（圖3-C～D）；33個MoLLEs在附著胞成熟（14～18 h）階段表達上調(diào)（圖3-A～B）。39個MoLLEs受到PMK1的調(diào)控，其中28個基因受PMK1正調(diào)控（圖3-A、C），10個基因受到PMK1負調(diào)控（圖3-B、D）。

經(jīng)交疊分析，發(fā)現(xiàn)大部分受饑餓誘導的MoLLEs基因（14/19）在附著胞成熟階段表達上調(diào)，其中7個基因也受PMK1正向調(diào)控（圖3-A），即：MGG_03495、MGG_05798、MGG_07699、MGG_08331、MGG_09842、MGG_13256、MGG_14572；此外2個MoLLEs同時受PMK負調(diào)控（圖3-B），即MGG_03042、MGG_08624。

相比附著胞成熟階段，只有少數(shù)饑餓誘導的MoLLEs基因（3/19）在附著胞發(fā)育初期表達上調(diào)（圖3-C～D），即MGG_04452、MGG_09333、MGG_10280；另外7個受PMK1正調(diào)控的MoLLEs也在該階段上調(diào)表達（圖3-C），即MGG_07824、MGG_08454、MGG_11397、MGG_14388、MGG_14641、MGG_14830、MGG_15374。然而，尚未發(fā)現(xiàn)有MoLLEs基因同時受饑餓、PMK1正調(diào)控并且在附著胞發(fā)育初期上調(diào)表達。4個附著胞發(fā)育初期上調(diào)表達的MoLLEs基因受PMK負調(diào)控（圖3-D），即：MGG_00074、MGG_08041、MGG_08275、MGG_10024。

2.4 稻瘟病菌MoLLEs家族基因在侵染階段的表達模式

利用RNAseq進一步分析在不同互作模式下MoLLEs家族基因的表達模式。將稻瘟病菌Guy11分別接種抗病水稻Pid3、感病水稻TP309，并以營養(yǎng)菌絲為對照，對不同接種時間段發(fā)病水稻葉片進行轉錄組測序?？傮w來看，大部分MoLLEs基因在菌絲階段轉錄水平較低或者不表達，但超過70個基因在侵染階段轉錄表達。

親和與非親和互作反應共同激活了一批MoLLEs家族基因的轉錄（圖4），如MGG_04451、MGG_10080、MGG_10086、MGG_10280、MGG_12654、MGG_13108、MGG_15374、MGG_16327、MGG_16489、MGG_16647、MGG_17659、MGG_17767、MGG_17896。

在與水稻Pid3的非親和反應中（圖4），MGG_0074、MGG_05504、MGG_07871、MGG_15547、MGG_17767和MGG_18035在菌絲階段不表達，在接種24 h后轉錄水平上升，而在接種36 h則無轉錄信號。此外，MGG_05429、MGG_08411、MGG_09842、MGG_09844、MGG_17406也有類似的表達模式，這些基因在接種36 h后表達水平下降?？梢姡@些MoLLEs基因可能參與稻瘟病菌侵染早期某些活動。但也有11個MoLLEs在接種后36 h才轉錄上調(diào)，如MGG_02508、MGG_03495、MGG_06861、MGG_07591、MGG_08331、MGG_08624、MGG_09848、MGG_09666、MGG_14572、MGG_14830、MGG_18141。其中MGG_03495、MGG_08331和MGG_14830僅在非親和的36 hpi轉錄表達。

相對于Pid3抗病水稻，Guy11菌株與TP309水稻的感病反應也誘導了一些36 hpi特異表達的MoLLEs基因（圖4），比如MGG_03760、MGG_05831、MGG_07699、MGG_09648、MGG_10065、MGG_12551、MGG_13256、MGG_13374、MGG_14388、MGG_17146和MGG_17464。據(jù)此推斷，這11個MoLLEs基因可能參與感病反應侵染菌絲的擴展或該階段的其他活動中發(fā)揮功能。

3 討論

真菌病原菌通過分泌一些效應因子來抑制寄主免疫反應，從而實現(xiàn)成功侵染和定殖。一部分攜帶激發(fā)子功能的效應因子可誘導植物產(chǎn)生過敏性細胞壞死，另一部分效應因子則可抑制植物細胞壞死[46]。在稻瘟病菌中，至少10個效應因子被證實可引起植物發(fā)生細胞壞死，如MoHrip1[47]、MoHrip2[48]、Nep1[49]、MoNLP1[50]、MoNLP2[50]、MoNLP4[50]、MoCDIP1 [51]、MoCDIP2[51]、MoCDIP3[51]、MoCDIP4[51]、MSP1[52]、MoSM1[53-54]等。雖然這類蛋白在序列上相似性低，但對植物免疫力的影響類似，如MoHrip1、MoHrip2、MSP1、MoSM1可提高水稻的免疫力。無毒蛋白AvrPiz-t可抑制由BAX介導的細胞死亡[55-56]，并且AvrPiz-t轉基因水稻對稻瘟病菌抵抗力較弱[56]。AVR Pii蛋白則可攻擊氧化還原中間體，抑制寄主水稻細胞氧爆發(fā)[57]。AVR Pii含有類LxAR基序，基于此，本研究通過生物信息學方法得到了99個含LxAR基序的稻瘟分泌蛋白（MoLLEs）序列。大部分MoLLEs基因編碼小分子未知蛋白，其氨基酸在70～300 aa之間。除了LxAR基序之外，含有已知功能域的MoLLEs編碼了三大代謝（糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝）相關蛋白，其中有9個MoLLEs還編碼了植物細胞壁降解酶，這預示著稻瘟病菌可能調(diào)用這類蛋白來降解水稻細胞壁以促進侵染。氨基酸的組成往往影響蛋白的功能，比如半胱氨酸構成的二硫鍵在維持蛋白結構上起重要作用。已知的多個無毒蛋白富含半胱氨酸，如AvrPiz-t[55]、AVR Pii[57]。其中AvrPiz-t成熟蛋白含有4個半胱氨酸，對其進行點突變導致AvrPiz-t喪失無毒功能[56]。本研究中，MoLLEs家族蛋白含有數(shù)量不等的半胱氨酸殘基，以1～3個為主，4～6個次之，這與常見效應因子特征相符，然而他們的具體功能有待進一步研究。

從營養(yǎng)菌絲到分生孢子、附著胞，稻瘟病菌經(jīng)歷了不同生理形態(tài)的變化。這些過程離不開一系列基因的時空表達調(diào)控。MoLLEs家族蛋白數(shù)量眾多，涉及多種類型蛋白，因此MoLLEs基因的表達模式可能與稻瘟病菌生長發(fā)育相關。從分生孢子萌發(fā)、附著胞形成，再到附著胞成熟、穿刺植物表層，這個過程營養(yǎng)匱乏，因此菌體必然啟動抵抗饑餓機制，以保證菌體的正常發(fā)育。據(jù)Soanes等[44]報道，饑餓脅迫可能成為一種信號，使某些基因在附著胞發(fā)育階段上調(diào)表達。除了饑餓脅迫之外，附著胞發(fā)育相關的磷酸激酶PMK1也是一個重要的方向指標。稻瘟病菌PMK1基因編碼磷酸激酶MAP kinase，在附著胞生長發(fā)育和致病性中起重要作用[40]。PMK1調(diào)控多種生理活動，最終影響稻瘟病菌在寄主體內(nèi)的定殖[44]。本研究分析了營養(yǎng)脅迫、附著胞不同發(fā)育階段下MoLLEs家族基因的表達模式，發(fā)現(xiàn)絕大部分受饑餓誘導的MoLLEs成員（14/19）在附著胞成熟階段（14～16 h）上調(diào)表達。在這些基因中，7個MoLLEs受到PMK1正向調(diào)控，2個MoLLEs受PMK1負調(diào)控向調(diào)控，2個MoLLEs受PMK1負調(diào)控。相比之下，在附著發(fā)育初期（4～8 h）則沒有MoLLEs同時受營養(yǎng)脅迫和PMK1調(diào)控，由此可見，響應饑餓脅迫并受PMK1正向調(diào)控的MoLLEs可能參與附著的形態(tài)建成。

稻瘟病菌與水稻的相互作用模式符合基因-基因假說。本研究中大部分MoLLEs基因在菌絲階段轉錄水平較低或者不表達，超過70個基因受侵染階段轉錄表達。在稻瘟病菌Guy11菌株與抗病水稻Pid3的非親和反應中，MoLLEs家族基因表達模式不盡相同。侵染菌絲形成階段（24 hpi）和擴展階段（36 hpi）均有特異表達的基因。而在親和反應中，這些基因幾乎不表達，推測這類家族成員可能在稻瘟病菌Guy11-水稻Pid3互作中起作用。在與水稻TP309的感病反應中，另外一部分MoLLEs在侵染36 h后轉錄上調(diào)，可能作為毒力因子來抑制水稻免疫反應。除此之外，親和、非親和反應也共同調(diào)控了一批MoLLEs基因，然而這些基因的功能有待于進一步分析與驗證。

本研究分析了該家族蛋白的性質(zhì)、演化特征及在長發(fā)育、致病過程中的表達特點，項目組將通過農(nóng)桿菌介導的煙草瞬時表達系統(tǒng)、基因敲除等系統(tǒng)進一步篩選影響稻瘟病菌-水稻相互作用的家族成員，以期為稻瘟病菌致病基礎提供理論基礎。

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