方波脈沖電轉化釀酒酵母條件優(yōu)化

胡明瑜 白文欽 潘曉雪 吳紅 雷開榮

摘? ?要? ?方波脈沖對細胞電擊轉化的效果優(yōu)于指數(shù)波脈沖。目前，酵母電轉化常使用的是指數(shù)波脈沖，方波脈沖轉化酵母的研究較少。為了優(yōu)化方波脈沖轉化釀酒酵母的條件，在1M山梨醇的電擊緩沖體系中，以釀酒酵母營養(yǎng)缺陷型菌株EGY48為試驗對象，使用方波脈沖轉化質粒，通過統(tǒng)計酵母轉化子數(shù)量，摸索和優(yōu)化脈沖電壓、脈沖次數(shù)和脈沖寬度的參數(shù)。試驗結果顯示，脈沖電壓為500 V，脈沖寬度為15 ms，脈沖次數(shù)為1～3次時，方波脈沖轉化酵母的效率較高。

關鍵詞? ?方波脈沖;電轉化;釀酒酵母;脈沖電壓;脈沖寬度;脈沖次數(shù)

中圖分類號：Q78? ? 文獻標志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.34.017

方波是一種特殊的脈沖波，在峰值和低值之間瞬時變換。在對細胞進行方波電擊時，脈沖電壓瞬間達到峰值，維持一定的脈沖寬度后，瞬間降為低值，完成一次方波脈沖。已有大量研究表明，方波脈沖對細胞電擊轉化的效果好于指數(shù)衰減脈沖波。Takahashi等[1]對人白血病細胞K562進行基因電擊轉化，在β-半乳糖苷酶基因瞬時表達試驗中，指數(shù)衰減波的轉化率僅為1%，方波脈沖的轉化率約為5%，而且細胞存活率更高;在新霉素抗性基因的細胞轉化試驗中，方波脈沖轉化率接近1%，指數(shù)衰減波轉化率不到0.01%。Liu等[2]用熒光標記的寡聚核苷酸，比較方波脈沖和指數(shù)波脈沖轉化不同造血細胞的效果，方波脈沖轉染效率更高，而且轉入的寡聚核苷酸的活性更強。Vierra等[3]對玻璃海鞘（Ciona intestinalis）的受精卵進行電擊轉化，兩種脈沖方式轉化的LacZ基因在胚中瞬時表達效率接近，而方波脈沖轉化后，正常發(fā)育胚的比例更高。此外，利用方波脈沖對血吸蟲、豬胎成纖維細胞等成功轉入RNA、DNA等生物大分子[4-5]。這些研究表明方波脈沖電轉化效率高、適應性廣，具有較廣泛的用途。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是真核單細胞微生物，基于釀酒酵母開發(fā)的分析技術已廣泛應用于不同生物的生長發(fā)育、病原與寄主的致病/抗病機理、生物與環(huán)境/激素信號應答等多方面的研究。釀酒酵母易于培養(yǎng)，可作為生物反應器大規(guī)模生產難以化學合成的生物活性大分子。例如，Callari等[6]在釀酒酵母中分別表達細菌中的ssf基因簇和不同植物來源的酯酰輔酶A連接酶基因，用于合成具有抗癌、抗炎、抗痙攣等活性的當歸酯化物前體當歸酰輔酶A。優(yōu)化的生物反應器以丙酸為底物，產生的當歸酰輔酶A滴度達到6.4 mg·L-1;以當歸酸為底物產生的當歸酰輔酶A滴度達到40 mg·L-1。釀酒酵母的轉化方法有化學法和電擊法，其中電擊法常用的是指數(shù)衰減脈沖波，而利用方波脈沖對酵母轉化質粒等大分子的研究較少。冀照君等[7]在0.6 mol·L-1的蔗糖溶液中優(yōu)化了方波脈沖電穿孔酵母細胞的條件，表明方波脈沖可以有效增強酵母細胞通透性，但沒有開展酵母轉化試驗。本試驗在1M山梨醇的電擊緩沖體系中，以釀酒酵母EGY48營養(yǎng)缺陷型菌株為研究對象，優(yōu)化方波脈沖電擊參數(shù)，建立了穩(wěn)定的方波脈沖電轉化方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 酵母菌株和質粒

從OriGene公司購買DupLEX-ATM酵母雙雜交試劑盒。使用的酵母為營養(yǎng)缺陷型菌株EGY48（MATα，trp1，his3，ura3，leu2：：6，LexAop-LEU2），該菌株已導入pSH18-34報告質粒和pEG202-GID1質粒，這兩個質粒分別包含URA3和HIS3基因。試驗中，酵母轉化用pJG4-5-D8N質粒包含TRP1基因。

1.1.2 主要生化試劑

山梨醇、尿嘧啶、組氨酸、色氨酸、YNB均購于上海生工生物有限公司。

1.1.3 主要儀器和耗材

ECM830型方形波電轉儀和1 mm電轉化杯為美國BTX公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母感受態(tài)細胞制備

每組處理使用同一批酵母感受態(tài)細胞進行試驗，參照OriGene公司試劑盒操作指南和BTX公司ECM 399型電轉化儀實驗指南制備感受態(tài)細胞。用接種環(huán)取EGY48菌株在YNB（-His-Ura）平板上劃線培養(yǎng);30 ℃下培養(yǎng)3 d后，挑取單菌落，接種于10 mL YNB（-His-Ura）液體培養(yǎng)基，30℃、200 rpm培養(yǎng)16～

20 h;取100 μL培養(yǎng)液稀釋10倍，測量OD600吸光值為0.5～0.8;吸取1.25～2.00 mL菌液到100 mL YNB（-His-Ura）液體培養(yǎng)基，30℃、200 rpm培養(yǎng)5～6 h，OD600吸光值為0.6～0.8;5 000 rpm離心5 min，去掉上清，收集菌體，加入30 mL冰預冷的無菌水，重懸菌體;用無菌水重復清洗兩次;離心收集菌體，倒掉上清，加入20 mL預冷的1M山梨醇重懸;離心后，去掉上清，加入1.2 mL預冷的1M山梨醇重懸;按每管70μL分裝，備用。

1.2.2 酵母轉化

用試劑盒提取pJG4-5-D8N質粒，測定濃度為

350 ng/μL;取1 μL加入酵母感受態(tài)細胞，輕輕混勻;冰上靜置5 min，輕輕吸出加入預冷的電擊轉化杯;按照文中表述的不同參數(shù)電擊轉化;迅速向電擊杯加入1 mL預冷的1M山梨醇;吸出菌液，轉移到1.5 mL離心管，離心收集菌體;用殘留的少量上清液重懸菌體后，菌液轉移到YNB（-His-Ura-Trp）平板上推平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。

1.2.3 酵母轉化率

每個電擊轉化事件中，pJG4-5-D8N質粒用量約為350 ng。酵母轉化率換算為每微克質粒轉化子數(shù)，應乘以2.86系數(shù)。

1.2.4 酵母轉化子驗證

制備少量酵母菌液作為模板，用引物對D8N-1（5′-AAGCGCGAGTACCAAGACGCC-3′）和D8N-2（5′-CACGGCGGGCGGGAGATCG-3′）進行擴增驗證。擴增條件為：98 ℃預變性5 min，1個循環(huán);94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳約20 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。

2 結果與分析

2.1 方波脈沖電壓優(yōu)化

ECM830型方形波電轉化儀有低壓和高壓兩種電擊模式，低壓模式電壓范圍是5～500 V，脈沖寬度為10 μs～10 s;高壓模式電壓范圍是505～3 000 V，脈沖寬度10～500 μs。由于低壓和高壓模式的脈沖寬度范圍限制，分別選擇低壓模式脈沖電壓500 V和高壓模式脈沖電壓750 V，進行酵母電轉化試驗。電擊轉化結果表明，設置脈沖電壓500 V，脈沖寬度4 ms，單次脈沖僅能獲得1～2個轉化子;脈沖2次，能獲得約10個轉化子。而在高壓模式下，脈沖電壓750 V，脈沖寬度400 μs，分別脈沖5、8和10次，僅能獲得少量轉化子（見表1）。這說明采用低壓模式，設置方波脈沖電壓500 V較適合酵母轉化。

2.2 方波脈沖次數(shù)優(yōu)化

在低壓模式下，設置脈沖電壓500 V，脈沖寬度4 ms，脈沖次數(shù)分別設為2、3、4、5、6次，對酵母進行電轉化。結果表明，脈沖2次獲得酵母轉化子數(shù)量較少;脈沖5次、6次，酵母轉化子數(shù)量在10～20;脈沖4次酵母轉化子達到30個;脈沖3次獲得的酵母轉化子最多，達到77個（見表2）。這說明在脈沖電壓500 V、脈沖寬度4 ms的條件下，脈沖3次的酵母轉化效率較高。

2.3 脈沖寬度優(yōu)化

在低壓模式下，設置脈沖電壓500 V，脈沖寬度分別為5 ms、10 ms、15 ms、20 ms、25 ms。通過單次脈沖轉化酵母，比較不同脈沖寬度的電轉化效果。結果表明（見表3），脈沖寬度為5 ms、10 ms時，獲得酵母轉化子數(shù)量分布在25～46;脈沖寬度為15 ms時，獲得酵母轉化子急劇增加到167個;脈沖寬度增加為20 ms、25 ms時，酵母轉化子數(shù)量反而降低，而且分別有約20.1%和31.7%的菌落在培養(yǎng)3 d后才出現(xiàn)，生長速度減緩。這說明用脈沖電壓500 V進行單次電擊，脈沖寬度在15 ms時，酵母轉化效率較高。

2.4 不同脈沖寬度3次脈沖的轉化效果比較

在低壓模式下，設置脈沖電壓500 V，脈沖次數(shù)為3次，脈沖寬度分別為5 ms、10 ms、15 ms、20 ms、25 ms。酵母轉化結果表明，脈沖寬度為10 ms、15 ms、20 ms時，酵母轉化子數(shù)量均分布在50～70范圍內;脈沖寬度為25 ms時，獲得的酵母轉化子分布在60～90范圍內（表4）。然而，觀察菌落生長情況，發(fā)現(xiàn)10 ms和15 ms脈沖處理酵母轉化子生長速度較快，菌落大小均勻一致;而20 ms和25 ms處理中，分別約有49.5%和72.3%菌落在培養(yǎng)3 d后才出現(xiàn)，生長速度減緩。

2.5 酵母轉化子鑒定

每個平板隨機挑取酵母單菌落，在10 μL的ddH2O中吹吸混勻，取1 μL混懸菌液為模板，擴增D8基因片段。電泳結果顯示，在所有檢測的酵母單菌落中均擴增出約500 bp的目標片段，而未轉化質粒的酵母陰性對照中不能擴增出目標帶（見圖1）。這表明在YNB（-His-Ura-Trp）平板中生長的酵母單菌落為陽性轉化子。

3 小結

ECM830型方形波電轉化儀在不同脈沖電壓模式下，脈沖寬度范圍不同，在高壓模式下，脈沖寬度上限僅為500 μs。而采用指數(shù)衰減波電轉化酵母時，常用脈沖寬度為4～4.5 ms。推測在高壓模式下，脈沖寬度可能難以滿足酵母電轉化條件。試驗中，設置脈沖電壓750 V，脈沖寬度400 μs，脈沖10次，僅獲得極少的酵母轉化子，表明在高壓模式下電轉化酵母難度較大。因此，選擇在脈沖電壓500 V的低壓模式下，優(yōu)化方波脈沖電轉化條件。

脈沖次數(shù)是電轉化的一個重要參數(shù)，脈沖次數(shù)太少對細胞的穿孔效果不好，影響質粒進入細胞;脈沖次數(shù)過多，對細胞造成的損傷大，細胞難以存活，導致轉化效率降低。試驗中，脈沖電壓500 V，脈沖寬度4 ms，脈沖3次時轉化效率最高，達到77個，進一步增加脈沖次數(shù)，轉化子數(shù)量反而逐漸減少。表明脈沖寬度在4 ms 及更長時，脈沖次數(shù)應該在3次以內。

在酵母電轉化過程中，脈沖電壓為500 V時，獲得大量的酵母轉化子，表明在細胞兩側施加的電壓能夠產生微孔，并且微孔大小可以使質粒進入細胞。脈沖寬度也是電轉化的重要參數(shù)，對細胞膜微孔的形成、形態(tài)維持、孔徑大小有重要影響。在脈沖電壓為500 V時，分析了不同脈沖寬度對酵母轉化的影響，試驗顯示，脈沖寬度為15 ms時，獲得的酵母轉化子最多，達到167個，遠遠高于其他脈沖寬度處理獲得的酵母轉化子數(shù)量。這說明脈沖電壓為500 V，脈沖寬度為15 ms，單次脈沖在細胞膜表面產生的微孔數(shù)量和大小最有利于質粒轉移。

進一步探討不同脈沖寬度多次脈沖電轉化酵母的效果，結果顯示脈沖寬度為10 ms、15 ms、20 ms和25 ms時，酵母轉化子數(shù)量分布在50～90，沒有明顯差異。然而，脈沖寬度為20 ms和25 ms時，可能對細胞傷害較大，分別約有49.5%和72.3%的菌落生長速度減緩。綜合試驗結果，方波脈沖電轉化酵母，脈沖電壓為500 V，脈沖寬度為15 ms，脈沖次數(shù)為1～3次時，質粒轉化效率較高。

參考文獻：

[1] M. Takahashi， T. Furukawa， H. Saitoh， et al. Gene transfer into human leukemia cell lines by electroporation： experience with exponentially decaying and square wave pulse[J]. Leukemia Research，1991，15（6）：507-513.

[2] Y. Liu， R. Bergan. Improved intracellular delivery of oligonucleotides by square wave electroporation[J]. Antisense and Nucleic Acid Drug Development，2001，11（1）：7-14.

[3] D.A. Vierra， S.Q. Irvine. Optimized conditions for transgenesis of the ascidian Ciona using square wave electroporation[J]. Development Genes and Evolution，2012，222（1）：55-61.

[4] J.M. Correnti， E.J. Pearce. Transgene expression in Schistosoma mansoni： introduction of RNA into schistosomula by electroporation[J]. Molecular and Biochemical Parasitology，2004，137（1）：75-79.

[5] J.W. Ross， J.J. Whyte， J. Zhao， et al. Optimization of square-wave electroporation for transfection of porcine fetal fibroblasts[J]. Transgenic Research，2010，19（4）：611-620.

[6] R. Callari， D. Fischer， H. Heider， et al. Biosynthesis of angelyl-CoA in Saccharomyces cerevisiae[J]. Microbial Cell Factories，2018，17（1）：72.

[7] 冀照君，孫波，遲玉杰，等.方波脈沖電穿孔法提高酵母菌細胞通透性的條件優(yōu)化[J].食品科學，2010，31（15）：50-54.