基于功能組分提升的藥渣濾液培養(yǎng)技術(shù)研究

陳霞 胡留杰 聶銘 孫志洪 謝永紅

摘? ?要? ?中藥渣濾液已經(jīng)成為制約中藥材產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題。以藿香正氣液藥渣濾液為原料，以YEM為菌劑，研究了其發(fā)酵基質(zhì)、參數(shù)及發(fā)酵組分變化，以期為藥渣濾液的快速微生物處理與高效利用提供技術(shù)支撐。研究結(jié)果表明，藿香正氣液藥渣濾液發(fā)酵培養(yǎng)基適宜配比為：添加蔗糖3%、硫酸銨0.3%、硝酸鈣0.1%、復(fù)合氨基酸0.4%、磷酸二氫鉀0.2%;適宜的菌種接種量為2%，適宜的培養(yǎng)溫度為30 ℃，適宜的通氣量為200 mL/（min·m3）。整個(gè)發(fā)酵期間，藥渣水發(fā)酵液總黃酮含量增加36.9%，標(biāo)志性藥效成分從發(fā)酵前的10種增加到發(fā)酵后的16種，有8種主要藥效成分的峰面積顯著增加，藥用組分峰面積增加40%，藥效組分含量總體提高。

關(guān)鍵詞? ?藥渣濾液;菌劑;培養(yǎng)基;發(fā)酵;功能組分

中圖分類號(hào)：Q946;S182? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.34.010

藥渣濾液成分復(fù)雜，具有污染物濃度高、色度深、可生化性差、毒性強(qiáng)、難降解等特點(diǎn)，其處理利用一直是亟待解決的難點(diǎn)。傳統(tǒng)藥渣濾液處理沿用工業(yè)污水處理排放工藝，藥效資源未能有效利用。目前制藥廢水處理技術(shù)主要包括吸附法、光降解法、膜分離法、厭氧法、好氧法等，以微生物厭氧、好氧及其組合工藝較為普遍。微生物發(fā)酵顯著提高藥渣濾液的有效組分和藥效，在動(dòng)物保健領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。韓春楊等利用由黃芪、黨參、茯苓、山楂、麥芽和白術(shù)通過(guò)微生物發(fā)酵處理，發(fā)酵前后中藥制劑液相色譜圖對(duì)比表明，中藥在發(fā)酵過(guò)程中，經(jīng)過(guò)微生物的降解作用和細(xì)胞壁的分解，有效成分可以最大限度游離出來(lái)，使得藥物成分有所增加，并且含量比發(fā)酵前升高了很多。但不同藥渣濾液間其發(fā)酵微生物菌種、發(fā)酵基質(zhì)與參數(shù)等均有所不同。本文以藿香正氣液藥渣濾液為原料，以前期篩選出的抗藥性YEM菌株為菌劑，研究了藥渣濾液發(fā)酵基質(zhì)、參數(shù)等兼氧連續(xù)發(fā)酵工藝，同時(shí)對(duì)其組分變化進(jìn)行了測(cè)定，為藥渣濾液的快速微生物處理與高效利用提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藥渣濾液：取自太極集團(tuán)涪陵制藥廠藿香正氣液藥渣壓榨水。藥渣水顏色深褐色，pH值為6.5～6.8，懸浮顆粒含量1.2%～1.5%，COD為9 300～9 800 mg·L-1，TSS含量2.9%～3.1%，含總氮800～870 mg·L-1、總糖1 050～1 120 mg·L-1、總黃酮870～960 mg·L-1。試驗(yàn)菌劑為本課題組前期分離出的YEM菌劑。

1.2 試驗(yàn)方法

發(fā)酵培養(yǎng)基配方試驗(yàn)：按L16（45）正交表進(jìn)行藥渣濾液處理培養(yǎng)基配方試驗(yàn)。各因素和水平：蔗糖添加比例設(shè)置為2%、3%、4%、5%四個(gè)水平，硫酸銨添加比例設(shè)置為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%四個(gè)水平，硝酸鈣添加比例設(shè)置為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%四個(gè)水平，復(fù)合氨基酸添加比例設(shè)置為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%四個(gè)水平，磷酸二氫鉀添加比例設(shè)置為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%四個(gè)水平。將100 mL培養(yǎng)基裝于250 mL三角瓶?jī)?nèi)，棉塞密封并121 ℃滅菌，冷卻后每瓶培養(yǎng)基接種2 mL YEM菌劑活化液，于25 ℃培養(yǎng)5 d，取發(fā)酵液測(cè)定菌液OD550值。

發(fā)酵參數(shù)試驗(yàn)：利用優(yōu)化培養(yǎng)基配方，在50 L發(fā)酵罐中設(shè)置1%、2%、3%菌種接種量，25 ℃、30 ℃、35 ℃培養(yǎng)溫度，100， 200， 300 mL/（min·m3）充氣量，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，每天取發(fā)酵液測(cè)定菌液OD550值。

藥渣濾液發(fā)酵試驗(yàn)：在150 L發(fā)酵罐中，按最佳發(fā)酵參數(shù)與藥渣濾液培養(yǎng)基配方進(jìn)行發(fā)酵處理，每天取樣測(cè)定菌液OD550值和進(jìn)行組分檢測(cè)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)和方法

發(fā)酵液光密度采用550 nm分光光度法測(cè)定;COD采用多參數(shù)水質(zhì)分析儀測(cè)定;粗纖維含量采用重量法測(cè)定;粗蛋白含量采用凱氏定氮法測(cè)定;總黃酮含量采用360 nm分光光度法測(cè)定。

發(fā)酵液組分測(cè)定：液相色譜法。將發(fā)酵前后的液體樣品分別以8 000 r·min-1離心5 min，取上清液進(jìn)行液相色譜測(cè)定。液相色譜條件如下。1）色譜柱，鉆石C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;2）檢測(cè)器，Waters2487紫外雙波長(zhǎng)檢測(cè)器;3）流動(dòng)相，A. pH值為3.25的磷酸溶液，B. 乙腈;二元梯度洗脫，洗脫條件為：0～5 min，A（%）10-10，B（%）90-90;5～25 min，A（%）10- 20，B（%）90-80;2～27 min，A（%）20-30，B（%）80-70 ;27～38 min，A（%）30-35，B（%）70 -65;38～40 min，A（%）35-40，B（%）65-60;40～50 min，A（%）40-40，B（%）60-60;檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm;檢測(cè)柱溫25 ℃;靈敏度0. 8AUFS;流速1 mL·min-1;樣品進(jìn)樣量5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基配方篩選

發(fā)酵培養(yǎng)基配方試驗(yàn)結(jié)果（見表1）表明，各添加組分對(duì)菌株生長(zhǎng)都有顯著影響。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果的極差分析，在藥渣水培養(yǎng)基中，硫酸銨和蔗糖的添加比例對(duì)發(fā)酵菌株的生長(zhǎng)影響最大，其次是硝酸鈣，復(fù)合氨基酸和磷酸二氫鉀的添加比例對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響相對(duì)較小。從各添加組分的效應(yīng)分析可知，藥渣濾液發(fā)酵培養(yǎng)基適宜配比為：蔗糖3%、硫酸銨0.3%、硝酸鈣0.1%、復(fù)合氨基酸0.4%、磷酸二氫鉀0.2%。

2.2 藥渣濾液發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 溫度

從圖1可知，在25～35 ℃溫度范圍，發(fā)酵菌株在中藥渣水培養(yǎng)基中均能正常生長(zhǎng)，隨著時(shí)間的增加，表現(xiàn)出先升后降的規(guī)律。與25 ℃培養(yǎng)條件相比，30 ℃培養(yǎng)的菌株活菌數(shù)量顯著增加，菌株最大生長(zhǎng)量在接種培養(yǎng)5 d到達(dá)，比25 ℃培養(yǎng)提前1 d;而35 ℃培養(yǎng)條件下，單培養(yǎng)基中活菌數(shù)量無(wú)明顯增加，而且在發(fā)酵培養(yǎng)6 d以后菌株老化嚴(yán)重，活菌數(shù)量下降較快?？梢?，在藥渣發(fā)酵處理中適宜的培養(yǎng)溫度為30 ℃，可保障菌株在藥渣水培養(yǎng)基的快速生長(zhǎng)，保持菌株活性。

2.2.2 接種量

從圖2可知，YEM菌劑3種不同接種量在藥渣濾液培養(yǎng)基中菌株的生長(zhǎng)速度差異明顯，其中1%的菌種接種量啟動(dòng)速度慢，在7 d以后才達(dá)到較高的活菌密度;3%接種量處理提前達(dá)到活菌最大值，但后期菌株老化較快;2%菌種處理具有明顯的菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，藥渣濾液培養(yǎng)基中活菌數(shù)量多，穩(wěn)定時(shí)期較長(zhǎng)，利于藥渣濾液的降解轉(zhuǎn)化。因此認(rèn)為，在藥渣濾液培養(yǎng)基中適宜的菌種接種量為2%。

2.2.3 通氣量

由于藥渣水組分復(fù)雜，在微生物降解過(guò)程中需要厭氧和好養(yǎng)處理，才能降解木質(zhì)素、纖維素和分解細(xì)胞壁，同時(shí)將粗蛋白轉(zhuǎn)化為氨基酸等小分子物質(zhì)。通過(guò)每間隔2 h通氣10 min發(fā)酵罐內(nèi)好養(yǎng)、厭氧循環(huán)處理過(guò)程，以進(jìn)一步提高微生物對(duì)藥渣濾液的處理效果。不同通氣量試驗(yàn)結(jié)果見圖3，可以看出，在低通氣量100 mL/（min·m3）條件下，培養(yǎng)液中菌株生長(zhǎng)緩慢，以厭氧菌為主要優(yōu)勢(shì)菌種;在高通氣量300 mL/（min·m3）條件下，培養(yǎng)液中菌株前期生長(zhǎng)快，而且活菌數(shù)量較多，以好養(yǎng)菌為主要優(yōu)勢(shì)菌種;在200 mL/（min·m3）條件下，培養(yǎng)液中菌株前期生長(zhǎng)快，而且活菌數(shù)量最多，活性保持時(shí)間長(zhǎng)。分析主要原因?yàn)檫m宜的通氣量利于在發(fā)酵罐中形成穩(wěn)定的厭氧和好養(yǎng)循環(huán)環(huán)境，利于各種菌株的生長(zhǎng)，充分發(fā)揮厭氧菌和好養(yǎng)菌的降解功能。由此認(rèn)為，在藥渣濾液微生物發(fā)酵處理中，適宜的通氣量為200 mL/（min·m3），利于形成穩(wěn)定的厭氧和好養(yǎng)循環(huán)發(fā)酵環(huán)境。

2.3 藥渣濾液微生物培養(yǎng)效果

采用150 L發(fā)酵罐在優(yōu)化的藥渣濾液培養(yǎng)基配方和發(fā)酵控制參數(shù)條件下進(jìn)行藥渣濾液微生物發(fā)酵處理，結(jié)果見表2。在藥渣濾液培養(yǎng)基中發(fā)酵微生物菌株在發(fā)酵后4～5 d達(dá)到最大活菌密度，發(fā)酵液OD550達(dá)到1.83;隨著培養(yǎng)液中養(yǎng)分的消耗降低，微生物數(shù)量逐漸減少。發(fā)酵液pH值從6.8下降到3.5左右，一直保持酸性狀態(tài)，主要原因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生大量乳酸。發(fā)酵液COD在發(fā)酵初期變化較小，與發(fā)酵液中微生物數(shù)量少、酶活性低有關(guān);在發(fā)酵4 d后，發(fā)酵液COD顯著下降，到第6天后COD維持在700 mg·L-1以下較低水平，呈緩慢下降趨勢(shì)，在整個(gè)發(fā)酵處理過(guò)程中，COD下降94.6%。發(fā)酵液中纖維素的降解與COD變化規(guī)律一致，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中纖維素降解率達(dá)97.3%，后期發(fā)酵液中纖維素含量低于45 mg·L-1。發(fā)酵液中粗蛋白含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，其增加速度與微生物數(shù)量增加基本同步，在整個(gè)發(fā)酵處理過(guò)程中，藥渣濾液粗蛋白含量增加4～5倍，維持在1 100～1 280 mg·L-1范圍。從發(fā)酵液中微生物生長(zhǎng)及主要物質(zhì)的降解動(dòng)態(tài)分析，整個(gè)藥渣水微生物處理周期為7 d以內(nèi)。

2.4 藥渣濾液發(fā)酵液組分與含量的變化

藥渣水發(fā)酵液總黃酮含量的變化：由表2可見，藥渣水在微生物發(fā)酵過(guò)程中總黃酮含量逐漸增加，尤其是發(fā)酵后4～6 d微生物數(shù)量和酶活性快速增加期間，發(fā)酵液總黃酮含量快速提高，后期穩(wěn)定在1 250～1 280 mg·L-1范圍，整個(gè)發(fā)酵期間，藥渣水發(fā)酵液總黃酮含量增加36.9%。

藥渣水發(fā)酵液組分的變化：對(duì)藥渣水微生物發(fā)酵前后各組分液相色譜分離檢測(cè)結(jié)果表明，絕大多數(shù)吸收峰的保留時(shí)間一致，其中7個(gè)主要藥效成分保留時(shí)間一致。發(fā)酵后的制劑中標(biāo)志性藥效成分從發(fā)酵前的10種增加到發(fā)酵后的16種，有8種主要藥效成分的峰面積顯著增加，藥用組分峰面積增加40%，表明藥效組分含量總體提高，與發(fā)酵液中總黃酮含量增加36.4%的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

用選育的YEM抗藥性菌劑進(jìn)行藥渣廢濾液發(fā)酵處理，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化獲得藥渣濾液發(fā)酵培養(yǎng)基適宜配比為：添加蔗糖3%、硫酸銨0.3%、硝酸鈣0.1%、復(fù)合氨基酸0.4%、磷酸二氫鉀0.2%。在pH值為6.5，2%菌種接種量，30 ℃培養(yǎng)溫度和每間隔2 h通氣10 min，通氣量200 mL/（min·m3）條件下，藥渣濾液發(fā)酵周期為7 d，實(shí)現(xiàn)藥渣廢濾液連續(xù)進(jìn)料快速微生物處理;在藥渣濾液功能組分提升定向培養(yǎng)過(guò)程中COD下降94.6%，纖維素降解97.3%，粗蛋白含量增加4～5倍，總黃酮含量增加36.4%，發(fā)酵液氣味清香;通過(guò)發(fā)酵前后的藥劑色譜圖比較，絕大多數(shù)吸收峰的保留時(shí)間一致，發(fā)酵后的制劑中標(biāo)志性藥效成分從發(fā)酵前的10種增加到發(fā)酵后的16種，有8種主要藥效成分的峰面積顯著增加，藥用組分含量總體提高40%左右;說(shuō)明發(fā)酵處理增加了藥渣水藥效組分，提高了藥效有關(guān)成分含量。