煙草半胱氨酸蛋白酶的生物學分析

馬世明 羅家佐 王德勛 戶艷霞 范志勇 蘇家恩

摘要 [目的]研究煙草半胱氨酸蛋白酶的生物學特性。[方法]通過PROTPARAM、CLUSTAL、MEGA、TMHMM、WOLF-PSORT、SOPMA工具對煙草半胱氨酸蛋白酶的理化特性、進化樹和跨膜結構進行生物學分析。[結果]NtCP-3和NtCP-4氨基酸個數(shù)（361）最大，NtCP-5氨基酸個數(shù)（349）最小；NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3和NtCP-4為酸性，NtCP-5為堿性；NtCP均屬于穩(wěn)定性蛋白，且NtCP-1和NtCP-2的耐熱性較好；NtCP-3和NtCP-4屬于親水性蛋白，其余為兩性蛋白；NtCP被分為3個亞組，NtCP-1和NtCP-2為一組，NtCP-3和NtCP-4為一組，NtCP-5單獨成一組；NtCP均屬于跨膜蛋白，且NtCP-5具有2個跨膜結構。[結論]煙草半胱氨酸蛋白酶的生物學特性為廣泛地參與煙草的生理反應奠定基礎。

關鍵詞 煙草；半胱氨酸蛋白酶；生物學

中圖分類號 S188文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）16-0017-03

Abstract [Objective] The research aimed to study the biological characteristics of tobacco cysteine protease. [Method]The physical and chemical properties， phylogenetic tree and transmembrane structure of tobacco cysteine protease were analyzed by using PROTPARAM， CLUSTAL， MEGA， TMHMM， WOLFPSORT and SOPMA respectively.[Result]The amino acid numbers of NtCP3 and NtCP4 were the largest （361）， and the NtCP5 amino acid number was the smallest （349）；NtCP1， NtCP2， NtCP3 and NtCP4 were acidic， and NtCP5 was alkaline；NtCP belonged to the stability protein， and the heat resistance of NtCP1 and NtCP2 were better；NtCP3 and NtCP4 were hydrophilic proteins， and the rest were amphoteric proteins；NtCP was divided into three subgroups， NtCP1 and NtCP2 were one group， NtCP3 and NtCP4 were a group， and NtCP5 was a single group；NtCP belonged to transmembrane protein， and NtCP5 had 2 transmembrane structures.[Conclusion]The biological characteristics of tobacco cysteine protease laid the foundation for extensively participating in the physiological response of tobacco.

Key words Tobacco；Cysteine protease；Biology

半胱氨酸蛋白酶屬于水解蛋白酶類的一部分，催化底物反應[1]，在植物的部分生理反應時參與其中，如儲存蛋白于細胞中的沉淀[2]，或動員及降解[3-4]；抵抗或緩解非生物脅迫（鹽脅迫、干旱和損傷等）[1，5-6]、生物脅迫（病菌侵染）[7-8]；參與植物細胞的衰老和程序性的死亡[9-10]。近年來，關于半胱氨酸蛋白酶的生物學研究主要集中在草莓[11]、番木瓜[12]、西瓜[13]等，而有關煙草半胱氨酸蛋白酶的生物學特性研究鮮見報道。筆者通過鑒定煙草半胱氨酸蛋白酶理化特性、分析各成員的進化樹和跨膜結構，為初步研究煙草半胱氨酸蛋白酶的特性提供依據。

1 材料與方法

1.1 煙草半胱氨酸蛋白酶家族成員的獲取

通過美國NCBI數(shù)據庫[14]，獲取煙草半胱氨酸蛋白酶的蛋白序列，其登錄號分別為ABW71226.1、BAA96501.1、ACB70409.1、AAW78660.1和ADV41672.1，并分別對其進行命名NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3、NtCP-4和NtCP-5[15]。

1.2 方法

以理化特性PROTPARAM的工具[16]，對煙草半胱氨酸蛋白酶的氨基酸數(shù)、分子量、理論等電點、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族指數(shù)和親水性進行分析；以CLUSTAL和MEGA工具[17-18]對成員進行進化樹分析；以TMHMM工具[19-20]分析各成員的跨膜結構。

2 結果與分析

2.1 煙草半胱氨酸蛋白酶的理化特性分析

運用PROTPARAM對NtCP進行相關理化特性分析，結果發(fā)現(xiàn)（表1），NtCP-1和NtCP-2的氨基酸數(shù)相等，均為360個，NtCP-3和NtCP-4均為361個氨基酸，NtCP-5為349個氨基酸；分子量較大的蛋白為NtCP-4，而NtCP-5的分子量最小；經過煙草半胱氨酸蛋白酶的等電點測定，NtCP的酸堿性存在分化，NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3和NtCP-4均呈現(xiàn)酸性，且NtCP-3和NtCP-4的酸性相對較強，NtCP-5呈現(xiàn)堿性；NtCP-3和NtCP-4的不穩(wěn)定指數(shù)相對較大，但均小于40，即NtCP均屬于穩(wěn)定性蛋白；NtCP-1和NtCP-2的脂肪指數(shù)較大，即NtCP-1和NtCP-2的耐熱性較好；NtCP-3和NtCP-4的親水性平均指數(shù)均小于-0.5，即NtCP-3和NtCP-4屬于親水性蛋白，NtCP-1、NtCP-2和NtCP-5的值大于-0.5，且小于0.5，則NtCP-1、NtCP-2和NtCP-5屬于兩性蛋白質。

2.2 煙草半胱氨酸蛋白酶的進化樹分析

運用NtCP的氨基酸序列與玉米和番茄的半胱氨酸蛋白酶的氨基酸序列進行同源比對，并構建進化樹，結果如圖1所示。根據同源性，可將NtCP分為3個類別：第1類為NtCP-1和NtCP-2與玉米的CAA68192的同源性最大，其值為100%；第2類為NtCP-3 和NtCP-4與番茄的CEL26633同源性較大，其同源性為85%；第3類為NtCP-5與玉米的ONL99021和ABW97700，以及番茄的AAM19209、AFP73354和AFP73353的同源最大（88%），表明煙草中的NtCP-1和NtCP-2聚成一類，NtCP-3和NtCP-4聚成另一類，NtCP-5為一類。通過進化樹分析，說明煙草的NtCP具有多種保守性序列，每個NtCP具有特異的保守性序列，且該蛋白酶的進化與玉米和番茄的進化較為相似，NtCP-1和NtCP-2與NtCP-3、NtCP-4、NtCP-5的分化時間較長。

2.3 煙草半胱氨酸蛋白酶的跨膜結構分析

由于蛋白的跨膜結構存在，有利于蛋白錨定于質膜上，進而在特定的位置發(fā)揮作用。因此，對NtCP進行跨膜結構的預測，詳情如圖2。

從圖2可看出，NtCP各成員均包含多個跨膜螺旋域，NtCP-1和NtCP-2共同具有3個從內向外的跨膜螺旋域，分別處于164～184位（score=321）、198～216位（score=153）、343～360位（score=92）的氨基酸，其特有的分別為4～29（score=2 391）、6～22（score=2 219），而從外向內共有的跨膜螺旋域為2個，分別處于195～215（score=7）、305～325（score=464），其特有的分別為6～29（score=2 220）、6～22（score=2 219）；NtCP-3和NtCP-4共同具有3個從內向外的跨膜螺旋域，分別為4～21（score=1 229）、147～165（score=424）、251～271（score=76），從外向內共有的跨膜螺旋域為1個148～165（score=127），其特有的分別為4～21（score=913）、3～19（score=810）；NtCP-5從內向外的跨膜螺旋域為3個，分別為3～22（score=2193）、151～168（score=214）和274～294（score=872），從外向內的跨膜螺旋域為2個，分別為6～24（score=1 829）和274～294（score=761）。當score > 500時，蛋白序列存在跨膜結構的可能性較大。綜上所述，NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3和NtCP-4均具有1個跨膜結構，分別位于相應序列的第4～29、6～22、4～21和4～19位氨基酸；NtCP-5具有2個跨膜結構（6～22和274～294）。

3 結論與討論

通過檢測煙草半胱氨酸蛋白酶的等電點，NtCP-1、NtCP-2、NtCP-3和NtCP-4呈酸性，NtCP-5呈堿性，有利于NtCP在酸堿環(huán)境保持活性，且NtCP均屬于穩(wěn)定性蛋白，進而為其廣泛地參與植物的生理反應提供保障[21]；NtCP-1和NtCP-2的熱穩(wěn)定性較強，且屬于兩性蛋白質，即有利于NtCP-1和NtCP-2參與較多的生理反應；通過進化樹分析，NtCP被分為3個亞組，表明煙草半胱氨酸蛋白酶在進化的過程中發(fā)生分化，進而分化為不同類型的蛋白家族（Papain、legumain、caspase、calpain）[1-2，22-23]；煙草半胱氨酸蛋白酶均含有跨膜結構，且均位于蛋白序列的N端，表明NtCP屬于跨膜蛋白，進而有助于膜外的N端接受信號，作用于效應區(qū)域（蛋白序列的C端），從而發(fā)揮作用[24]。

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