液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測豬肉中25種β—受體激動劑

胡佳哲 梁賢凱 賴宇紅

摘要 [目的]建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速同時測定豬肉中克倫特羅、西馬特羅、溴代克倫特羅、馬布特羅、羥甲基克倫特羅、溴布特羅、福莫特羅、馬賁特羅、苯氧丙酚胺、拉貝特羅、氯丙那林、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、妥布特羅、特布他林、萊克多巴胺、菲諾特羅、克倫塞羅、齊帕特羅、克倫潘特、克倫特羅、西布特羅、班布特羅、丙卡特羅、沙美特羅25種β-受體激動劑的分析方法。[方法]樣品經(jīng)0.2 mol/L磷酸-甲醇（1∶1）提取，Bond ElutPlexa PCX小柱凈化，Thermo Accucore Phenyl Hexyl（2.6 μm，100 mm×2.1 mm）色譜柱分離，電噴霧正離子模式測定，內(nèi)標(biāo)法定量。[結(jié)果]25種β-受體激動劑在2.5～100.0 μg/L呈良好線性關(guān)系，決定系數(shù)R.2均大于0.990，在豬肉中的檢出限為0.2～1.2 μg/kg，在2.5、5.0和10.0 μg/kg 3個加標(biāo)水平下的回收率為83.70%～112.20%，RSD為0.18%～10.10%。[結(jié)論]該方法前處理簡單、靈敏度高、適用性好，可用于批量豬肉中25種β-受體激動劑的快速確證分析。

關(guān)鍵詞 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；β-受體激動劑；快速檢測；豬肉

中圖分類號 S851.34.+7 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）23-0155-06

Abstract [Objective] The research aimed to establish a method of rapid simultaneous determination of clenbutero，cimaterol，bromchlorbuterol，mabuterol，hydroxymethylclenbuterol，brombiterol，formoterol，mapenterol，tsoxsuprine，labeiterol，clorprenaline，salbutamol，phenylethanolamineA，tulobuterol，terbutalin，ractopamine，fenoterol，clencyclohexerol，zilpaterol，clenpenterol，clenbuterol，cimbuterol，bambuterol，procaterol，salmeterol twentyfive kinds of beta receptor agonists by liquid chromatographytandem mass spectrometry.[Method]The sample was extracted by 0.2 mol/L phosphatemethanol （1：1），and the extracts were purified by Bond Elut Plexa PCX，after being eluted from the cleanup column，the analytes were separated on a Thermo Accucore Phenyl Hexyl （2.6 m，100 mm x 2.1mm） column and detected by electrospray mass spectrometry in positive ionization mode with multiple reaction monitoring.The method was quantitatively detected by internal standard method.[Result]The linear ranges of twentyfive kinds of betareceptor agonist were in the range of 2.5-100.0 μg/L with correlation coefficients higher than 0.990.The limits of detection（LOD） were 0.2-1.2 μg/kg.The recoveries of 2.5，5.0 and 10.0 μg/kg was 83.70%-112.20%，and the relative standard deviation （RSD） was 0.18-10.10%.[Conclusion] This method is simple，sensitive and applicable，and can be used for the rapid confirmation analysis of twentyfive kinds of betareceptor agonist in pork.

Key words Liquid chromatographytandem mass spectrometry；Betareceptor agonist；Rapid detection；Pork

β-受體激動劑，俗稱瘦肉精，是具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)的腎上腺素類合成藥物[1]。在臨床上，β-受體激動劑可以放松支氣管平滑肌，增加纖毛運動頻率，調(diào)節(jié)黏膜纖毛的清除率，可以用于治療支氣管炎和哮喘等疾病[2-3]。這類藥物結(jié)構(gòu)中的活性基團，在動物體內(nèi)能結(jié)合組織細(xì)胞膜中的β-受體，從而發(fā)生一系列生理效應(yīng)，可以促使平滑肌擴張，增加肺活量，同時干擾胰島素的釋放，加快體內(nèi)糖原和脂肪的分解[4]。在動物飼養(yǎng)過程使用這類藥物，可提高飼料的轉(zhuǎn)化率，達到營養(yǎng)再分配的作用，進而明顯提高動物的瘦肉率[5]。β-受體激動劑類藥物有較強的蛋白質(zhì)同化作用，殘留的瘦肉精通過食物鏈會被人體吸收進而造成人體中毒。人食用有瘦肉精殘留的食物后，會出現(xiàn)肌肉振顫、心慌、戰(zhàn)栗、頭疼、惡心、嘔吐等癥狀[6]，對于患有高血壓、心臟病、甲亢和前列腺肥大等疾病的人影響和危害更大，嚴(yán)重者可危及生命[7]。

目前，關(guān)于β-受體激動劑類藥物殘留檢測方法大多采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）[8-17]，多數(shù)選擇酶解、酸化水溶液提取、堿化有機溶劑提取、陽離子交換固相萃取凈化，步驟操作繁瑣，費時，干擾因素多。針對我國消費量較大的豬肉，構(gòu)建前處理快速簡便、能同時測定20余種β-受體激動劑的LC-MS檢測方法，以有效控制動物源性食品中該類藥物的殘留量具有十分重要的現(xiàn)實意義。筆者采用酸化提取并通過Bond Elut Plexa PCX固相萃取凈化的預(yù)處理，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進行分離檢測，快速測定和分析豬肉中25種β-受體激動劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。LC-20ADXR/四元梯度泵高效液相色譜（日本Shimadzu 公司）；TripleQuad5500三重四極桿質(zhì)譜檢測系統(tǒng)（美國AB SCIEX 公司）；Thermo X1R低溫高速離心機（美國Thermo公司）；多功能渦旋混合器（Talbous公司）；HY-2A調(diào)速多功能振蕩器（江蘇常州澳華儀器有限公司）；Labtech MV5自動氮吹儀（LabTech公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）。

1.1.2 主要試劑?？藗愄亓_、西馬特羅、溴代克倫特羅、馬布特羅、羥甲基克倫特羅、溴布特羅、富麻酸福莫特羅、馬賁特羅、苯氧丙酚胺、拉貝特羅、氯丙那林、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、托布特羅、特布他林、萊克多巴胺、菲諾特羅、克倫塞羅、齊帕特羅、克倫潘特、克倫特羅、西布特羅、班布特羅、丙卡特羅、沙美特羅、沙丁胺醇-D3、克倫特羅D9標(biāo)準(zhǔn)品，購自德國Dr.Ehrensorfer公司；均質(zhì)子、Bond Elut Plexa PCX小柱（200 mg，6 mL），均購自美國Aligent公司；甲醇、乙腈試劑，均產(chǎn)自美國Merck公司，均為色譜純；甲酸試劑，產(chǎn)自美國Fluka公司，色譜純；其他未作特殊說明的試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備。

1.2.1.1 25種β-受體激動劑儲備溶液。準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶，配制成1.0 mg/mL的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.2 25種β-受體激動劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別移取適量的單標(biāo)儲備液，用甲醇逐級稀釋成濃度為1.0 mg/L的25種β-受體激動劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.3 內(nèi)標(biāo)儲備溶液。準(zhǔn)確稱取沙丁胺醇-D3和克倫特羅-D9各10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶，配制成1.0 mg/mL的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.4 內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。分別移取適量的內(nèi)標(biāo)單標(biāo)儲備液，用甲醇逐級稀釋成濃度為50 ng/mL的內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 供試品溶液的制備。稱取2.0 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中，加入100 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液（濃度為50 ng/mL），渦旋混勻，加入一枚均質(zhì)子和0.2 mol/L磷酸-甲醇（1∶1）10 mL，水平振蕩20 min，在4 ℃、10 000 r/min離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，殘渣用0.2 mol/L磷酸10 mL再提取1次，合并2次上清液，在4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清液備用凈化。

Bond Elut Plexa PCX小柱（200 mg，6 mL），依次用5 mL甲醇和5 mL水活化，將上述待凈化液加入小柱中，待流干，依次用5 mL水和5 mL甲醇淋洗，棄掉，用5 mL 5%氨水甲醇洗脫，收集流出液。將流出液在50 ℃下氮氣吹至近干，用2 mL 0.1%甲酸-甲醇（9∶1）復(fù)溶，充分溶解，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.2.3 儀器分析條件。

1.2.3.1 液相色譜條件。色譜柱為Thermo Accucore Phenyl Hexyl（2.6 μm，100 mm×2.1 mm）；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；流動相A為0.1%甲酸水（含5 mmol/L乙酸胺），流動相B為0.1%甲酸乙腈。洗脫梯度：0～1.0，5%B；1.0～3.5，5%～35%B；3.5～6.0，35%～80%B；6.0～8.0，80%B；8.0～8.1，80%～5%B；8.1～10.0，5%B。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（ESI），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），正離子模式；噴霧電壓5.5 kV；氣簾氣壓力0.24 MPa；碰撞氣壓力0.02 MPa；溫度500 ℃；碰撞室入口電壓10 V；碰撞室出口電壓12 V；駐留時間50 ms；離子源Gas1和Gas2均為0.50 MPa。其他參數(shù)見表1。

1.2.4 方法學(xué)考察。

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。將25種β-受體激動劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按比例配制為2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL（內(nèi)標(biāo)物濃度均為2.5 ng/mL）6個濃度，按照“1.2.3”儀器分析條件測定，每次進樣10 μL，以對照品濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)、外標(biāo)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值R為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算線性回歸方程。

1.2.4.2 檢出限的考察。將25種β-受體激動劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋后進樣測定，以色譜圖中信噪比（S/N）為3時的進樣量為最低檢測限（LOD）。

1.2.4.3 加樣回收試驗和精密度試驗。選擇陰性豬肉樣品，精密添加適當(dāng)?shù)?5種β-受體激動劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察低（2.5 μg/kg）、中（5.0 μg/kg）、高（10.0 μg/kg）3個濃度水平的回收試驗，混合均勻后，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，再按“1.2.3”儀器分析條件測定，進樣量為10 μL，每個加標(biāo)水平平行測定6次，測定外標(biāo)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值R，計算平均回收率和精密度（RSD）。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 質(zhì)譜優(yōu)化采用微量進樣泵連續(xù)進樣的方式，分別對濃度為50 ng/mL的克倫特羅、西馬特羅、溴代克倫特羅、馬布特羅、羥甲基克倫特羅、溴布特羅、富麻酸福莫特羅、馬賁特羅、苯氧丙酚胺、拉貝特羅、氯丙那林、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、妥布特羅、特布他林、萊克多巴胺、菲諾特羅、克倫塞羅、齊帕特羅、克倫潘特、克倫特羅、西布特羅、班布特羅、丙卡特羅和沙美特羅的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行一級質(zhì)譜掃描，確定各個組分準(zhǔn)分子離子，優(yōu)化噴霧電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度、氣簾氣、霧化氣、輔助加熱氣條件，使25種β-受體激動劑母離子綜合響應(yīng)強度達到最佳。將獲得的母離子進行二級質(zhì)譜掃描，分別優(yōu)化25種β-受體激動劑的碎片離子，對去簇電壓、碰撞能量、碰撞室射出電壓進行優(yōu)化，選擇豐度較高的2個碎片離子作為定量和定性離子。

2.2 色譜條件的優(yōu)化 大多數(shù)β-受體激動劑類的色譜分離采用0.1%甲酸溶液和甲醇或乙腈組成的混合溶液作為流動相，試驗用0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水作為流動相時，發(fā)現(xiàn)菲諾特羅、苯乙醇胺A、丙卡特羅、沙美特羅的離子化程度不好，在水系流動相中添加少許乙酸銨，上述情況得到明顯改善，保證測定靈敏度的同時，化合物之間的分離度也得到進一步改善。試驗比較了0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L乙酸胺）和0.1%甲酸水溶液（含10 mmol/L乙酸胺）作為流動相，發(fā)現(xiàn)分離度與回收率并沒有隨著乙酸胺濃度升高而增高，因此最終選擇0.1%甲酸水（含5 mmol/L乙酸胺）和0.1%甲酸乙腈作為流動相。

2.3 提取溶劑的選擇 水解主要包括酸解和酶解，酶制劑本身及其水解的樣品往往可產(chǎn)生大量的干擾物質(zhì)，且酶解條件受酶種類、樣品基質(zhì)及水解條件不同而有所不同，而酸解的分析結(jié)果與酶解相近，且產(chǎn)生的干擾物質(zhì)較少，該研究采用酸解的方式進行水解。結(jié)合25種β-受體激動劑不同的極性，最后確定0.2 mol/L磷酸與甲醇同比例混合溶液進行水解提取。

2.4 固相萃取柱的選擇 由于動物源性食品中的基質(zhì)成分復(fù)雜，即使經(jīng)過0.2 mmol/L磷酸-甲醇（1∶1）提取后，提取液中含有很多雜質(zhì)干擾目標(biāo)物在儀器上的響應(yīng)。所以該試驗采用固相萃取小柱對提取液進一步的凈化和富集，并比較了常用的中性氧化鋁小柱、HLB小柱、硅膠小柱和PCX小柱等4種固相萃取小柱對25種β-受體激動劑的凈化效果，以25種待測物的平均加標(biāo)回收率作為比較依據(jù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比較其他幾款小柱，PCX小柱對樣品提取液的凈化效果好，加標(biāo)回收率最高。主要是因為在酸性條件下，PCX小柱能夠吸附具有一定弱堿性的β-受體激動劑，淋洗液淋洗雜質(zhì)后，再用堿性有機溶劑進行洗脫，洗脫液較為干凈，雜質(zhì)少，能對提取液起到很好的凈化效果。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系和檢出限的考察。按“1.2.4.1”和“1.2.4.2”方法操作，以β-受體激動劑的濃度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)組分的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，進行內(nèi)標(biāo)法校正，25種β-受體激動劑的線性結(jié)果見表2，決定系數(shù)R.2均大于0.990。以特征離子信噪比S/N>3對應(yīng)的濃度為檢出限，各待測物的檢出限為0.2～1.2 ng/mL，方法的靈敏度完全滿足國家標(biāo)準(zhǔn)對β-受體激動劑的限量檢測要求。

2.5.2 回收試驗和精密度的考察。按“1.2.4.3”方法操作，計算平均回收率和精密度（表3），色譜圖如圖1～3所示。從表3可看出，25種待測物的回收率為83.70%～112.20%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.18%～10.10%。表明該方法準(zhǔn)確、可靠，精密度良好，可用于豬肉等動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留的檢測。

3 結(jié)論

該研究建立了豬肉中25種β-受體激動劑的固相萃取凈化/液相色譜-質(zhì)譜的快速檢測方法。試驗優(yōu)化了色譜條件和質(zhì)譜參數(shù)，優(yōu)選出0.2 mol/L磷酸與甲醇同比例混合溶液提取和Bond Elut Plexa PCX凈化體系。方法學(xué)評價結(jié)果表明，25種β-受體激動劑在2.5～100.0 ng/mL呈良好線性關(guān)系，決定系數(shù)R.2均大于0.990，在豬肉中的檢出限為0.2～1.2 μg/kg。通過添加2.5、5.0和10.0 μg/kg的3個濃度水平回收試驗，發(fā)現(xiàn)25種β-受體激動劑的回收率為83.70%～112.20%，RSD為0.18%～10.10%。該方法前處理簡單、靈敏度高、適用性好，適用于大批量樣品的快速篩選和定量測定，為快速監(jiān)測豬肉乃至動物源性食品中禁用β-受體激動劑類物質(zhì)的殘留情況，提高監(jiān)管和產(chǎn)品質(zhì)量提供技術(shù)支持。

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