顯齒蛇葡萄多糖的提取及鑒定

潘欣妍 佟長青 趙菲

摘要 [目的]研究張家界巴沖寨發(fā)酵型顯齒蛇葡萄多糖的最佳提取條件。[方法]采用熱水浸提、乙醇沉淀的方法，以提取時(shí)間、提取溫度、料液比3個(gè)因素進(jìn)行單因素及正交試驗(yàn)，對獲得的顯齒蛇葡萄多糖單糖組成進(jìn)行分析。[結(jié)果]顯齒蛇葡萄的多糖最佳提取條件為95 ℃、料液比為1∶40（g/mL）、提取1.0 h，顯齒蛇葡萄多糖提取率為11.26%。單糖組成分析表明，顯齒蛇葡萄多糖由Man、GlcUA、Glc、Gal、Xyl組成，Man/GlcUA/Glc/Gal/Xyl的摩爾比（%）為29/10/7/18/37。[結(jié)論]通過水提醇沉法可以獲得顯齒蛇葡萄多糖。

關(guān)鍵詞 顯齒蛇葡萄；多糖；提??；鑒定

中圖分類號(hào) TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）23-0148-03

Abstract [Objective]To study the optimum extraction conditions of a polysaccharide from Ampelopsis grossedentata in Bachong Village of Zhangjiajie.[Method]The polysaccharide was extracted using hot water and ethanol precipitation method. Single factor experiment and orthogonal test were investigated by taking extraction temperature， extraction time and solidliquid ratio. The monosaccharide composition of the polysaccharide was analyzed. [Result] The optimum conditions were as follows： 95 ℃，1∶40 solidliquid ratio（g/mL） and 1.0 h for extraction. The extraction rate of the polysaccharides was 11.26%. The polysaccharide from A. grossedentata was composed mainly of Man， GlcUA， Glc， Gal and Xyl. Its monosaccharide composition normalized mol（%）Man/GlcUA/Glc/Gal/Xyl was 29/10/7/18/37. [Conclusion] Polysaccharide was extracted from A. grossedentata by waterethanol fractional precipitation method.

Key words Ampelopsis grossedentata；Polysaccharide；Isolation；Characterization

顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）是葡萄科蛇葡萄屬中的一種野生藤本植物，主要分布于湖南、湖北、江西、福建、廣東、廣西、云南、貴州等地[1]。它具有清熱解毒、祛風(fēng)濕等功效。民間將其嫩莖葉制成保健茶來治療感冒發(fā)燒、喉嚨腫痛、黃疸型肝炎、皰癤等癥，已有數(shù)百年的應(yīng)用歷史[2]。顯齒蛇葡萄的嫩葉經(jīng)過殺青、揉捻、烘干而成的類茶飲料稱為藤茶、茅巖莓茶。藤茶為藥食兩用植物，加工的產(chǎn)品有藤茶餅、袋泡茶、速溶茶、含片以及果凍等[3-5]。

對于顯齒蛇葡萄的藥理活性部位，人們進(jìn)行了大量深入的研究。顯齒蛇葡萄含有較多的黃酮類物質(zhì)及多酚類化合物，而水溶性多糖及水溶性蛋白含量相對較少[6]。研究表明，多糖是藥源生物的重要活性物質(zhì)。人們在顯齒蛇葡萄多糖方面也進(jìn)行了大量研究。鄒艷梅等[7]研究了熱水浸提法提取顯齒蛇葡萄多糖的工藝，目的是確定采用最佳工藝提取不同時(shí)期顯齒蛇葡萄莖、葉多糖含量，8月份湖南懷化市的顯齒蛇葡萄莖、葉多糖含量分別為1.41%、2.79%。肖浩等[8]研究了響應(yīng)面法優(yōu)化“白露”發(fā)酵型藤茶黃酮和多糖的提取工藝，在提取溫度96 ℃、時(shí)間1.6 h、料液比1∶21（g/mL）的最優(yōu)條件下，總黃酮和多糖的提取率分別為22.94%和213%。王嵐等[9]采用超聲提取法對梵凈山野生藤茶多糖進(jìn)行提取，結(jié)果表明在料液比為1∶20（g/mL）、70%乙醇、溫度70 ℃以及提取時(shí)間50 min的最佳工藝條件下，藤茶多糖提取率為4.08%。熊偉等[10]采用熱水浸提法對江西撫州黎川產(chǎn)藤茶中二氫楊梅素和多糖進(jìn)行了同步提取，在提取溫度90 ℃、提取時(shí)間120 min、料液比1∶20的最佳工藝條件下，二氫楊梅素和多糖提取率分別為21.86%和5.74%。由此可見，不同產(chǎn)地、不同季節(jié)的顯齒蛇葡萄，其多糖提取率不同。筆者提取分離并初步鑒定了張家界巴沖寨發(fā)酵型顯齒蛇葡萄的多糖，以期為顯齒蛇葡萄的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料。茅巖莓茶，產(chǎn)于我國張家界巴沖寨。

1.1.2

試劑。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）、D-甘露糖（D-Man）、D-巖藻糖（D-Fuc）、D-鼠李糖（D-Rha）、D-葡萄糖（D-Glc）、葡萄糖醛酸（D-GlcUA）、D-木糖（D-Xyl）、D-半乳糖（D-Gal）及三氟乙酸（均為分析純），購于上海醫(yī)藥集團(tuán)；乙腈（色譜純），購于Fisher公司。

1.1.3

儀器。HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；GL21M型低溫冷凍離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；UV-1750型紫外可見分光光度計(jì)[島津儀器（蘇州）有限公司]；FD-1型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

1.2 方法

1.2.1 顯齒蛇葡萄多糖提取。采用熱水浸提方法提取顯齒蛇葡萄多糖。每次取干燥顯齒蛇葡萄葉10 g，分別在一定時(shí)間、一定溫度、一定料液比下進(jìn)行熱水浸提，抽濾得濾液。向?yàn)V液中加入4倍濾液體積的95%乙醇進(jìn)行沉淀。室溫下靜置12 h后在4 000 r/min條件下離心20 min，沉底用少量的蒸餾水溶解，冷凍干燥。

1.2.2

顯齒蛇葡萄多糖含量測定。顯齒蛇葡萄多糖含量測定采用苯酚-硫酸法。

1.2.3

單糖組成分析。稱取20 mg顯齒蛇葡萄多糖放于安瓿瓶中，再加入4 mL的4 mol/L三氟乙酸。吹氮?dú)夥饪?，燒結(jié)，在120 ℃下水解4 h之后，加入4 mL的4 mol/L NaOH溶液中和，即得到顯齒蛇葡萄多糖水解液。

取5 mg/mL甘露糖（Man）、巖藻糖（Fuc）、葡萄糖（Glc）、木糖（Xyl）、鼠李糖（Rha）、半乳糖（Gal）、葡萄糖醛酸（GlcUA）作為標(biāo)準(zhǔn)單糖。將200 μL標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液、顯齒蛇葡萄多糖水解液置于干凈的試管中，再分別加入100 μL的0.5 mol/L NaOH溶液及100 μL的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）溶液（以甲醇溶解配制成0.5 mol/L溶液）。70 ℃水浴1 h后加入100 μL的0.5 mol/L HCl中和，再加入0.9 mL三氯甲烷溶液，漩渦振蕩，徹底混勻。在8 000 r/min條件下離心10 min，取上清液，重復(fù)3次。

取20 μL以PMP標(biāo)記的單糖溶液或者樣品溶液通過C18柱（4.6 mm×150 mm）在HPLC上進(jìn)行分析。以溶劑A：含10%乙腈的0.1 mol/L pH 6.0的PB緩沖液，溶劑B：含25%乙腈的0.1 mol/L pH 6.0的PB緩沖液作為流動(dòng)相。時(shí)間梯度：0 min—10 min—20 min—40 min—50 min，相對應(yīng)的濃度為25%—50%—75%—90%—100%的溶劑B，流速為1 mL/min，設(shè)定紫外檢測波長為245 nm[11]。

1.2.4

紅外光譜（FT-IR）分析。取150 ℃下干燥3 h的溴化鉀藥品0.2 g，與0.002 g干燥的顯齒蛇葡萄多糖混合于瑪瑙研缽內(nèi)。研細(xì)混合均勻，轉(zhuǎn)至模具中，在壓力為30～40 mPa下進(jìn)行壓片，再將制好的壓片置于樣品架上，在波數(shù)400～4 000 cm.-1下進(jìn)行紅外掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯齒蛇葡萄多糖提取

2.1.1

提取溫度。由圖1可知，多糖提取率隨溫度的升高而升高，在95 ℃時(shí)提取率最高，95 ℃之后提取率有緩慢下降的趨勢，故95 ℃為顯齒蛇葡萄多糖最佳提取溫度。

2.1.2

提取時(shí)間。由圖2可知，多糖提取率隨提取時(shí)間的增加而升高，在提取時(shí)間為1.5 h時(shí)提取率最高，而后呈緩慢下降趨勢，故顯齒蛇葡萄多糖提取的最佳時(shí)間為1.5 h。

2.1.3

料液比。由圖3可知，在料液比1∶45（g/mL）條件下提取率最高，故顯齒蛇葡萄多糖提取的最佳料液比為1∶45（g/mL）。

2.1.4

正交試驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，以顯齒蛇葡萄多糖提取率為指標(biāo)，開展提取溫度、料液比和提取時(shí)間三因素三水平正交試驗(yàn)L9（3.3），正交試驗(yàn)因素及水平見表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

由表2可知，各因素對顯齒蛇葡萄多糖的提取工藝影響程度從大到小依次為B、A、C，即提取時(shí)間、提取溫度、料液比。A2B1C2為最佳工藝，即提取溫度95 ℃、提取1.0 h、料液比為1∶40（g/mL）為最佳提取條件。在最佳提取條件下，顯齒蛇葡萄多糖提取率為11.26%。這一多糖提取率遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的顯齒蛇葡萄多糖提取率[7-10]。

2.2 化學(xué)組成

HPLC結(jié)果表明，單糖出峰次序依次為Man、Rha、GlcUA、Glc、Gal、Xyl、Fuc（圖4A），顯齒蛇葡萄多糖由Man、GlcUA、Glc、Gal、Xyl組成（圖4B）。顯齒蛇葡萄多糖Man/GlcUA/Glc/Gal/Xyl的摩爾比（%）為29/10/7/18/37。HPLC單糖組成分析結(jié)果與羅祖友等[12]研究結(jié)果類似，都表明顯齒蛇葡萄多糖中含有GlcUA。

2.3 紅外光譜分析結(jié)果

由圖5可知，在3 376 cm.-1處為-OH的伸縮振動(dòng)吸收峰；2 919、2 850 cm.-1處為C-H的伸縮振動(dòng)吸收峰；1 652 cm.-1處為COO-的伸縮振動(dòng)吸收峰；1 421、1 373 cm.-1處為-CH2的變型吸收峰；1 326 cm.-1處為C-H彎曲振動(dòng)吸收峰；1 253、1 205 cm.-1處為2種C-O伸縮振動(dòng)引起的；1 151 cm.-1處為C-O吸收峰；1 083、1 031 cm.-1處為-OH的變角振動(dòng)吸收峰。

3 結(jié)論

利用熱水浸提、乙醇沉淀的方法從張家界巴沖寨發(fā)酵型顯齒蛇葡萄中提取出了多糖。以提取時(shí)間、提取溫度、料液比3個(gè)因素進(jìn)行單因素及正交試驗(yàn)結(jié)果表明，顯齒蛇葡萄的多糖最佳提取條件為95 ℃、料液比為1∶40（g/mL）、提取1.0 h。在最佳提取條件下，顯齒蛇葡萄多糖提取率為11.26%。單糖組成分析表明，顯齒蛇葡萄多糖由Man、GlcUA、Glc、Gal、Xyl組成，Man/GlcUA/Glc/Gal/Xyl的摩爾比（%）為29/10/7/18/37。

參考文獻(xiàn)

[1] 中國科學(xué)院植物研究所.中國高等植物圖鑒：補(bǔ)編2冊[M].北京：科學(xué)出版社，1983：349-356.

[2] 王文采.葡萄科的新發(fā)現(xiàn)[J].植物分類學(xué)報(bào)，1979，17（3）：110-112.

[3] 易誠.藤茶制作工藝初探[J].中國林副特產(chǎn)，2003（1）：46 -47.

[4] 姚茂君，曹庸，李國章，等.無糖型茅巖莓速溶茶的加工技術(shù)[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（11）：110 -113.

[5]張雁.顯齒蛇葡萄保健果凍的研制[J].食品科技，2002（7）：22 -23.

[6] 熊皓平，何國慶，楊偉麗，等.顯齒蛇葡萄生化成分分析[J].中國食品學(xué)報(bào)，2004，4（3）：68-71.

[7] 鄒艷梅，付明.顯齒蛇葡萄多糖的提取工藝及含量研究[J].懷化學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，30（S1）：39-42.

[8] 肖浩，鄭小江.響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵藤茶黃酮和多糖的提取工藝[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，31（2）：132-137.

[9] 王嵐，陳仕學(xué)，付喻，等.梵凈山野生藤茶茶多糖提取條件[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（8）：195-197.

[10] 熊偉，王慧賓，李雄輝，等.熱水浸提法同步提取藤茶中二氫楊梅素和多糖的工藝研究[J].生物化工，2015，1（1）：5-6，11.

[11] FU D T，ONEILL R A.Monosaccharide composition analysis of oligosaccharides and glycoproteins by high-performance liquid chromatography[J].Analytical biochemistry，1995，227（2）：377-384.

[12] 羅祖友，程超，李偉，等.藤茶水溶性多糖的分離純化及性質(zhì)的研究[J].食品科學(xué)，2007，28（1）：151-154.