不同提取方法對佛手多糖性質(zhì)和乙醇脫氫酶活性的影響

陳孝云 王洪新 呂文平

摘要 [目的]研究不同提取方法對佛手多糖理化性質(zhì)及乙醇脫氫酶活性的影響，為改進(jìn)佛手多糖生產(chǎn)方式和佛手多糖解酒研究提供依據(jù)。[方法]分別采用傳統(tǒng)水提法、超聲輔助法、微波輔助法、超聲-微波協(xié)同提取法和復(fù)合酶法提取佛手多糖，探討5種提取方法對多糖得率、糖醛酸含量、分子量、單糖組成、紅外光譜和乙醇脫氫酶活性的影響。[結(jié)果]水提法和超聲-微波協(xié)同提取多糖得率最高，分別為（4.26±0.21）%和（4.15±0.14）%。不同方法提取的佛手多糖分子量大小存在差異，其中復(fù)合酶法提取多糖平均分子量為617.85 kD，約是水提多糖分子量的4倍。5種多糖均呈現(xiàn)出典型的吡喃型多糖和α型糖苷鍵吸收，單糖組成均以阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖為主。超聲-微波協(xié)同提取多糖對乙醇脫氫酶激活能力最強(qiáng)，可達(dá)（46.58±1.76）%，而傳統(tǒng)水提多糖抑制乙醇脫氫酶活性。[結(jié)論]超聲-微波協(xié)同提取佛手多糖得率高且所需時(shí)間短，對乙醇脫氫酶激活能力強(qiáng)，推測乙醇脫氫酶激活能力與多糖分子量大小、半乳糖醛酸連接方式有關(guān)。

關(guān)鍵詞 佛手多糖；不同提取方法；理化性質(zhì)；乙醇脫氫酶

中圖分類號 R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）23-0131-05

Abstract [Objective] The research aimed to study the effect of different extraction methods on characteristics and alcohol dehydrogenase （ADH） activity of finger citron polysaccharides （FCPs），which provide the references for the development of extraction methods and hepatoprotective activity of FCPs.[Method]FCPs were extracted by five extraction methods， including traditional water extraction（TWE）， ultrasonic assisted extraction（UE）， microwave assisted extraction （ME）， ultrasonicmicrowave synergistic extraction （UMSE） and compound enzyme assisted extraction （CEE）. The impacts of different extraction methods on the yield of polysaccharides， uronic acid content， molecular weight， monosaccharide composition， IR spectrum and ADH activity were investigated. [Result]The yields of FCPs extracted by TWE and UMSE were （4.26±0.21）% and （4.15±0.14）%， respectively， which were higher than other extraction methods. There were differences in molecular weight of FCPs prepared by different extraction methods. Average molecular weight of polysaccharides prepared by CEE was 617.85 kDa， about 4 times than the polysaccharides by TWE. Five polysaccharides had typical absorption for pyran polysaccharides and αglycosidic bond. Monosaccharide composition mainly included arabinose， galactose， glucose. The polysaccharides extracted by UMSE had the highest activating effect on ADH， with a percentage activation of （46.58±0.26）%， but polysaccharides extracted by TWE inhibited the activity of ADH.[Conclusion]The polysaccharide prepared by UMSE has good yield， high efficiency and highest activating effect on ADH. The activation of ADH may be due to the molecular weight and galacturonic acid connection.

Key words Finger citron polysaccharides；Different extraction methods；Physicochemical properties；Alcohol dehydrogenase

佛手[Citrus medica L. var. sarcodactylis （Noot.） Swingle]是蕓香科（Rutaceae）柑橘屬（Citrus）植物佛手的干燥果實(shí)，又名佛手香櫞、蜜羅柑、福壽橘、九爪木、佛手柑、五指橘[1]。佛手化學(xué)成分包括黃酮類、揮發(fā)油類、香豆素類、多糖等?！侗静菥V目》載： “煮酒飲，治痰氣咳嗽；煎湯，治心下氣痛?！睋?jù)《歸經(jīng)》記載，佛手具有醒酒作用，是配制佛手中成藥的主要原料。目前，文獻(xiàn)尚未報(bào)道佛手中醒酒作用的成分。文獻(xiàn)已報(bào)道積椇子多糖[2]、桑葚多糖[3]、瑪咖多糖[4]、蘆薈多糖[5]、枸杞多糖[6]、霍山石斛多糖[7]等對酒精誘導(dǎo)肝損傷的保護(hù)作用。筆者以佛手多糖為研究對象，進(jìn)行解酒能力的初步研究。

乙醇主要在肝臟中進(jìn)行消除，肝臟的主要代謝通路分別是乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase， ADH）通路和以細(xì)胞色素P4502E1為主的微粒體乙醇氧化系統(tǒng)通路[8]。乙醇脫氫酶是肝臟乙醇代謝的主要酶，催化乙醇轉(zhuǎn)化為乙醛[9]。因此，探討多糖對乙醇脫氫酶活性的影響具有重大意義。

多糖的提取方法主要包括熱水提取法、酶法、微波輔助法、超聲輔助法、酸堿提取法等[10]。近年來，超聲-微波協(xié)同提取法應(yīng)用于多糖提取，具有能耗低、提取效率高的特點(diǎn)[11]，此方法在佛手多糖的提取應(yīng)用目前鮮見報(bào)道。筆者采用5種提取方法，依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道佛手多糖最佳提取條件來提取多糖[12-15]，探討多糖理化性質(zhì)差異，并采用瓦勒-霍赫法測定多糖對乙醇脫氫酶活性的作用，進(jìn)一步為佛手多糖解酒護(hù)肝研究提供酶學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材。金華佛手，產(chǎn)地是浙江省金華市。無水乙醇、苯酚、濃硫酸、四硼酸鈉、間羥基聯(lián)苯、硫酸鉀、濃鹽酸、半乳糖醛酸、明膠、氯化鋇、三氯乙酸、無水葡萄糖、焦磷酸鈉、明膠、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，均為分析純。纖維素酶（40 000 U/g）、酸性蛋白酶（50 000 U/g）、果膠酶（30 000 U/g），均購自上海源葉有限公司。氧化型輔酶Ι（純度≥98%）、乙醇脫氫酶（300 U/mg），分別購自Roche公司和Sigma公司。

1.1.2 儀器。

GZX-9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DL-5-B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；AVM602/WH型微波爐，飛利浦公司；YQ-1003D型超聲波儀，上海易凈超聲波儀器有限公司；HH-4數(shù)顯攪拌水浴鍋，常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；SCIENT-10N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV1800全波長掃描儀，日本島津公司；IS10傅里葉紅外光譜儀，美國Nicolet公司；WFZUV-2100型紫外-可見分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司；CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀，上海新拓分析儀器科技有限公司；全波長M5型酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 預(yù)處理。

將鮮佛手切片，50 ℃烘干，粉碎后過60目篩。料液比1∶8（M/V）加入95%乙醇于圓底蒸餾瓶中，70 ℃，95%乙醇回流2 h，重復(fù)2次，使內(nèi)源性酶失活，除去可溶性物質(zhì)。50 ℃烘箱揮干，儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同提取方法。

1.2.2.1 傳統(tǒng)水提法。稱取10 g佛手粉，按1∶30（g/mL）比例加入蒸餾水，90 ℃下浸提2 h[12]。4 500 r/min離心10 min除去濾渣，收集濾液。于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至100 mL。Sevage法除蛋白后，加入4倍體積 95%乙醇，于冰箱中4 ℃醇沉過夜。4 500 r/min離心 20 min，除去乙醇上清液，保留沉淀，50 ℃真空干燥，即得水提多糖（Traditional water extraction polysaccharides， TP）。

1.2.2.2 超聲輔助法。參考王琴等[13]的研究，并略作修改。稱取10 g佛手粉，按1∶30（g/mL）比例加入蒸餾水，超聲功率400 W，90 ℃，超聲30 min。4 500 r/min離心10 min除去濾渣，收集濾液。其余步驟同“1.2.2.1”，即得超聲提取多糖（Ultrasonic extraction polysaccharides， UP）。

1.2.2.3 微波輔助法。

稱取10 g佛手粉，按1∶30（g/mL）比例加入蒸餾水，微波功率550 W，微波8 min[14]。4 500 r/min離心10 min除去濾渣，收集濾液。其余步驟同“1.2.2.1”，即得微波提取多糖（Microwave extraction polysaccharides， MP）。

1.2.2.4 超聲-微波協(xié)同提取法。

稱取10 g佛手粉，按1∶30（g/mL）比例加入蒸餾水，超聲功率50 W，微波功率550 W，協(xié)同提取8 min。4 500 r/min離心10 min除去濾渣，收集濾液。其余步驟同“1.2.2.1”，即得超聲-微波協(xié)同提取多糖（Ultrasonic-microwave synergistic extraction polysaccharides， UMP）。

1.2.2.5 復(fù)合酶法。

參考章斌等[15]的研究，并略作修改。稱取10 g佛手粉，按1∶30（g/mL）比例加入蒸餾水，采用復(fù)合酶（纖維素酶∶酸性蛋白酶∶果膠酶=1∶1∶1），酶用量1.2%，溫度50 ℃，pH為5.0，酶解150 min后升溫至90 ℃，滅酶15 min。4 500 r/min離心10 min除去濾渣，收集濾液。其余步驟同“1.2.2.1”，即得酶提多糖（Enzyme extraction polysaccharides， EP）。

1.2.3 理化性質(zhì)測定。

1.2.3.1 佛手多糖得率。稱取佛手多糖質(zhì)量，采用苯酚-硫酸法[16]測定佛手多糖的含量，標(biāo)準(zhǔn)品采用無水葡萄糖，根據(jù)公式（1）計(jì)算出多糖得率。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

多糖得率=多糖質(zhì)量×多糖純度佛手粉質(zhì)量×100%（1）

1.2.3.2 佛手多糖糖醛酸含量測定。采用間羥基聯(lián)苯比色法[17]測定佛手多糖的糖醛酸含量。

1.2.3.3 佛手多糖硫酸根含量測定。采用硫酸鋇比濁法[18]測定佛手多糖的硫酸根含量。

1.2.3.4 佛手多糖蛋白質(zhì)含量測定。采用考馬斯亮藍(lán)方法[19]測定。

1.2.3.5 佛手多糖分子量測定。采用高效凝膠色譜法測定，配制2.0 mg/mL的多糖溶液，用0.22 μm無菌濾膜過濾，取過濾后上清液待用。采用Waters1525 高效液相色譜儀（配2414示差折光檢測器和Empower 3工作站），色譜條件：柱溫45 ℃；0.1 mol NaNO3為流動相，流速0.9 mL/min；色譜柱UltrahydrogelTM Linear，其中柱長300 mm，直徑為7.8 mm。配制一系列不同分子量的葡聚糖溶液作為標(biāo)樣，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品的分子量根據(jù)其相應(yīng)的洗脫體積對照標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3.6 佛手多糖單糖組成測定。

采用高效陰離子交換色譜法，稱取5 mg多糖樣品于5 mL安瓿瓶中，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸，吹氮?dú)猓芊猓?21 ℃烘箱水解3 h，用水定容至5 mL，用0.45 μm微孔濾膜過濾后供進(jìn)樣分析。色譜條件：CarboPac PA20色譜柱；脈沖安培檢測器；流動相為水，250 mmol/L NaOH，1 mol/L CH3COONa。流動相洗脫程序：0～21.0 min，97.4%水，2.6%NaOH溶液；21.1～30.0 min，92.4%水，2.6%NaOH溶液，5.0%CH3COONa；30.1～50.0 min，20%水，80%NaOH溶液；流速均為0.5 mL/min。

1.2.3.7 紅外光譜。采用KBr壓片法，多糖樣品和干燥KBr以1∶50混合，在瑪瑙研缽中混合研細(xì)均勻，在壓片機(jī)中壓成薄片，在4 000～500 cm-1掃描[20]。

1.2.4 佛手多糖對乙醇脫氫酶活性影響。

采用瓦勒-霍赫（Valle & Hoch）法[21]，并略作修改，來檢測ADH活性。試管中依次加入0.75 mL pH 8.8重磷酸鈉緩沖液、0.5 mL NAD輔酶溶液、0.25 mL乙醇和50 μL多糖樣品（pH 7.5磷酸鹽緩沖液配制），25 ℃保溫5 min。加入50 μL酶溶液，搖勻。立即吸取200 μL，加入酶標(biāo)板測定，在連續(xù)5 min內(nèi)，每隔10 s讀取波長340 nm處的吸光度，直至每分鐘吸光度的增大值達(dá)到穩(wěn)定為止?？瞻捉M，以50 μL pH 7.5的磷酸鹽緩沖液代替50 μL多糖樣品，其余步驟同上。采用以下公式計(jì)算ADH活性和激活率。

式中，E為ADH的酶活力（U/mL），其中E1為樣品組酶活力，E0為空白組酶活力；A為波長340 nm處吸光度每分鐘的增大值；Ew為酶液中所含的酶量（mg/mL）；1.6為反應(yīng)液的總體積（mL）；6.2為NADH的克分子吸光值系數(shù)；Q為ADH的激活率（%）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)測定的結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性檢驗(yàn)（P<0.05）以最小顯著性差異法（LSD）進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對佛手多糖得率的影響

從圖1可看出，TP和UMP的多糖得率無顯著性差異，分別為（4.26±021）%和（4.15±0.14）%。熱水提取，提取時(shí)間長達(dá)2 h，提取溫度高，有利于多糖溶出。超聲-微波協(xié)同提取法綜合超聲的空化作用和微波的高能作用，加速多糖從固相進(jìn)入溶劑的過程[22]。MP和EP的多糖得率低，分別為（3.12±015）%、（2.96±0.11）%。分析原因，復(fù)合酶法反應(yīng)溫度低，條件溫和，未能有效提取佛手多糖。此外，微波法為間歇式加熱，提取過程易產(chǎn)生大量泡沫，不利于佛手多糖提取。UP得率為（3.78±0.15）%，可能原因是超聲輔助法對多糖提取的提取條件不佳，造成細(xì)胞壁破壞不夠充分，多糖未能有效浸出。

2.2 不同提取方法對佛手多糖糖醛酸含量的影響

從圖2可看出，TP和MP的糖醛酸含量最高，兩者無顯著性差異，分別為（16.56±0.43）%和（16.21±0.30）%；其次是UP和UMP糖醛酸含量，兩者無顯著性差異，分別是（13.95±0.25）%和（14.26±0.36）%；EP糖醛酸含量最低，為（12.11±0.26）%。

2.3 不同提取方法對佛手多糖硫酸根含量和蛋白質(zhì)含量的影響 由表1可知，不同提取方法所得佛手多糖的蛋白質(zhì)含量低，表明多糖脫蛋白效果好；多糖硫酸根含量和多糖抗氧化性密切相關(guān)，5種佛手多糖硫酸根含量均低于1%。

2.4 不同提取方法對佛手多糖分子量的影響

PDI值即重均分子量（Mw）/數(shù)均分子量（Mn），反映樣品間分子量分布的寬度。從表2可看出，熱水提?。═P）的平均分子量最小，分子均一性較高，推測是高溫作用下，多糖大分子發(fā)生一定程度的降解。超聲-微波協(xié)同提取的多糖，分散系數(shù)最高，與文獻(xiàn)報(bào)道的特點(diǎn)相符合[23]。復(fù)合酶法（EP）提取多糖分子量最大，可能原因是酶反應(yīng)條件溫和，作用于細(xì)胞壁釋放多糖，未對多糖大分子進(jìn)行降解。

2.5 不同提取方法對佛手多糖單糖組成的影響 從表3可看出，TP、UP和EP以阿拉伯糖含量居多，分別占54.07%、47.24%、37.75%，其次是半乳糖，分別占15.06%、29.49%、24.79%；MP以阿拉伯糖居多，達(dá)32.47%，其次是葡萄糖，達(dá)31.39%；UMP以葡萄糖含量居多，達(dá)35.07%，其次是阿拉伯糖，達(dá)30.46%。綜上所述，5種提取方法所得多糖的單糖組成均以阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖為主，這與He等[24]研究的結(jié)論相符。結(jié)合上述糖醛酸含量分析，佛手多糖糖醛酸主要以半乳糖醛酸形式存在。

2.6 不同提取方法所得佛手多糖的紅外光譜

紅外分析（圖3）表明，5種提取方法所得多糖的紅外結(jié)構(gòu)表征一致，即5種提取方法所得佛手多糖具有相同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，這與不同提取方法提取桑黃多糖[25]研究相符。在3 500～3 000 cm-1處，強(qiáng)而寬的吸收峰是O—H伸縮振動，在3 000～2 800 cm-1的吸收峰是C—H伸縮振動，在1 200～1 000 cm-1是C—O—H的伸縮振動和C—O—C糖苷鍵振動，這些表明樣品為多糖[26]。5種多糖均在1 742和1 616 cm-1左右出現(xiàn)吸收峰，推斷是糖醛酸存在下，羧基基團(tuán)的C=O鍵的伸縮振動與糖醛酸含量測定結(jié)果相符合[27-28]。1 408 cm-1附近寬的吸收峰，與C—H鍵的變形振動有關(guān)系。1 234 cm-1的吸收峰，是由于S=O的伸縮振動，表明多糖含有硫酸基團(tuán)[29]。1 200～1 010 cm-1出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，表明存在吡喃糖苷鍵。831 cm-1處是α型糖苷鍵特征吸收峰[30]。921和762 cm-1分別是吡喃環(huán)的非對稱和對稱伸縮振動。

2.7 不同提取方法所得佛手多糖對乙醇脫氫酶活性的影響

由圖4可知，多糖濃度在1.0～10.0 mg/mL時(shí)，隨EP、UP、MP和UMP濃度升高，ADH激活率先增加再降低。當(dāng)UMP濃度在2.5 mg/mL時(shí)，對ADH激活效果最好，激活率可達(dá)（46.58±1.76）%；

當(dāng)EP濃度在2.5 mg/mL，ADH激活率可達(dá)（35.79±1.55）%；當(dāng)UP濃度為5.0 mg/mL時(shí)，ADH激活率可達(dá)（28.35±1.04）%；MP濃度為5.0 mg/mL時(shí)，ADH激活率可達(dá)（21.52±0.96）%。 TP多糖濃度為1.0～10.0 mg/mL時(shí)，ADH抑制率隨TP濃度升高而增加；TP濃度為10.0 mg/mL時(shí)，ADH抑制率達(dá)（18.60±1.02）%。

有文獻(xiàn)報(bào)道不同酶法提取桑葚多糖對ADH活性的影響[31]，筆者研究不同提取方法所得佛手多糖對ADH活性的影響。目前關(guān)于多糖影響ADH活性的研究，主要有非共價(jià)結(jié)合[32]和離子作用[33]2種機(jī)理。EP、UP、MP、UMP和ADH非共價(jià)結(jié)合形成復(fù)合物，提高ADH反應(yīng)速率起到激活作用。隨多糖濃度逐漸增大，體系中硫酸基團(tuán)等陰離子含量增加，作用于ADH、NAD的結(jié)合區(qū)，對ADH活性起到抑制作用。結(jié)合不同提取方法多糖理化性質(zhì)分析比較，推測TP、EP、UP、MP、UMP對ADH活性差異可能是由于糖醛酸連接位點(diǎn)不同[34]，以及TP分子量大小與其他4種多糖差異較大造成的[35]。

3 結(jié)論

該研究探討了5種提取方法對佛手多糖理化性質(zhì)和乙醇脫氫酶活性的影響，研究發(fā)現(xiàn)這5種提取方法對多糖得率、分子量、糖醛酸含量和乙醇脫氫酶活性影響較大，對單糖組成有一定影響，對多糖紅外結(jié)構(gòu)無顯著性影響。該研究首次采用超聲-微波協(xié)同提取法提取佛手多糖，研究發(fā)現(xiàn)該法提取多糖得率高，所需時(shí)間短，多糖對乙醇脫氫酶激活能力強(qiáng)。該研究還比較了不同提取方法提取佛手多糖對乙醇脫氫酶活性的影響，結(jié)合多糖理化性質(zhì)，推測佛手多糖半乳糖醛酸連接位點(diǎn)以及多糖分子量大小對乙醇脫氫酶活性有重要影響。

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