柞蠶核型多角體病毒基因組編碼的VmiRNA篩選及功能分析

劉丹梅 宋麗新 李文利

摘要 [目的]VmiRNA不僅可以控制自身基因，還可調(diào)節(jié)宿主的穩(wěn)定表達，研究VmiRNA的功能有助于從分子水平說明核型多角體病毒與柞蠶的寄生關(guān)系，從而改進對病毒的防控措施。[方法]利用生物信息學(xué)及實時定量PCR等分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，對柞蠶核型多角體病毒編碼的miRNA及其作用的靶標基因進行研究。[結(jié)果]經(jīng)預(yù)測和篩選得到了ApNPV編碼的miRNA MD217，與其有關(guān)的宿主靶基因14種，主要參與細胞組成、生化過程以及分子功能等途徑，涉及到生物體細胞內(nèi)一些催化、免疫反應(yīng)等過程；實時定量PCR結(jié)果表明，MD217在病毒感染后上調(diào)表達，脂肪體組織內(nèi)的靶基因MAPKK7表達水平與MD217的表達呈正相關(guān)。[結(jié)論]miRNA MD217在病毒感染后誘導(dǎo)表達，推測很可能降低了宿主免疫系統(tǒng)的防御能力，并同時影響靶基因MAPKK7的功能表達，從而避免了在免疫應(yīng)答過程中的免疫清除。

關(guān)鍵詞 柞蠶；核型多角體病毒；miRNA；靶標基因

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）23-0065-04

Abstract [Objective] VmiRNA can not only control its own gene，but also regulate the stable expression of the host.Studying the functions of VmiRNA can help to explain the parasitic relation between nuclear polyhedrosis virus and Antheraea pernyi on molecular level，thus improving preventions and controls of the virus.[Method] In this study，molecular biological techniques such as bioinformatics and Quantitative Realtime PCR were employed to research the miRNA of Antheraea pernyi nuclear polyhedrosis virus and its target gene.[Result] The miRNA MD217，which was encoded by ApNPV，was obtained by predicting and screening.The analysis showed that there were 14 host target genes related to MD217，and they were mainly involved in cell composition，biochemical processes，molecular functions and so on.They also referred to some processes in biological cells，such as catalysis and immunoreaction.The results of the Quantitative Realtime PCR showed that after the virus infection，MD217 upregulated the expression，and its expression was positively corrlated with the target gene MAPKK7 in adipose tissue.[Conclusion] The expression of miRNA MD217 was induced by virus infection.It was speculated to decrease the defense ability of the host immune system and affect the functional expression of the target gene MAPKK7 at the same time，thus avoiding the immune clearance in the immune response.

Key words Antheraea pernyi；Nuclear polyhedrosis virus；miRNA；Target gene

柞蠶核型多角體病毒（ApNPV）是柞蠶膿病的病原微生物[1]，屬桿狀病毒科包含體桿狀病毒亞科，核型多角體病毒屬。桿狀病毒是桿狀的包膜病毒，具有環(huán)狀雙鏈DNA，長度為80～18 000 kb，這些病毒感染了超過600個寄主物種，主要寄生于節(jié)肢動物中的鱗翅目、膜翅目和雙翅目昆蟲中[2]。桿狀病毒與宿主細胞相互作用機理研究，包括在病毒進入和結(jié)合時的相互作用，宿主基因表達調(diào)節(jié)，以及修飾與調(diào)節(jié)細胞和機體所發(fā)生的生理和防御的相互作用的復(fù)雜和微妙的機制等[3]。

MicroRNA簡稱miRNA，是真核生物中非編碼的內(nèi)源性小分子RNA，是由莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體物質(zhì)在核內(nèi)經(jīng)過一系列核酸酶的剪切運輸?shù)胶送饧庸こ墒煨纬傻腫4-5]，其本身不參與蛋白質(zhì)的編碼[6]，但卻參與剪切、降解、抑制翻譯以及染色體修飾等生物過程[7]。miRNA通過與靶標的結(jié)合程度不同來實現(xiàn)調(diào)控功能[8]，當miRNA與其靶標完全或近乎完全互補時，會引起mRNA降解而降低其表達；當兩者不完全互補時，主要通過抑制靶標mRNA的翻譯起作用[9]。

目前關(guān)于

核型多角體病毒編碼miRNA的研究還較少。2011年，陳蔚等[10]利用Vmir軟件成功地預(yù)測5條家蠶核型多角體病毒（BmNPV）編碼的miRNA成熟體序列，經(jīng)試驗分析得到6條成熟體序列，推測其可能參與并調(diào)節(jié)了病毒感染宿主的過程，但未進行試驗驗證。Zhang等[11]利用miRNA的調(diào)控機理，構(gòu)建了以BmNPV基因lef-1為靶基因的人工miRNA表達系統(tǒng)，成功利用RNA干擾技術(shù)產(chǎn)生了具有抑制病毒復(fù)制并降低病毒感染的成熟amiR2764和amiR279。李文利等[12]于2013年利用建立的柞蠶基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫和基因組GSS數(shù)據(jù)庫，在研究柞蠶核型多角體病毒編碼的miRNA靶基因時發(fā)現(xiàn)135個與柞蠶免疫相關(guān)的基因，研究表明這些基因主要參與免疫系統(tǒng)的發(fā)育、免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)等過程。

筆者通過生物信息學(xué)方法和分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)，對ApNPV編碼的miRNA進行篩選，并對VmiRNA的靶標基因進行預(yù)測；通過靶標基因功能分析及實時定量PCR驗證，期望明確ApNPV與宿主miRNA之間的關(guān)系，并為柞蠶膿病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 柞蠶青6滯育蛹、柞蠶核型多角體病毒均由大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院實驗室提供。

1.2 miRNA的前體預(yù)測

采用VMir Analyzer（version 2.3）軟件進行miRNA的前體預(yù)測。首先將ApNPV基因組（GenBank登錄號：NC_008035）導(dǎo)入VMir軟件中，設(shè)定序列最低得分150，最低窗口值35為條件初步篩選出病毒基因組編碼的miRNA前體序列。在RNAshapes軟件中得到前體序列的二級結(jié)構(gòu)，并利用RNAhybrid分析這些序列的最小折疊自由能等參數(shù)，預(yù)測候選的miRNA。依據(jù)保守性區(qū)域的變化、5端首個堿基U存在等條件，利用Mireap得到預(yù)測的成熟體序列。

1.3 miRNA的靶基因預(yù)測與功能分析

采用RNAhybrid在線預(yù)測軟件（http：//bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybridwelcome.htlm）預(yù)測miRNA靶基因。在軟件的窗口中輸入miRNA序列和柞蠶cDNA文庫的序列，經(jīng)過分析得到相關(guān)的靶基因。將預(yù)測得到的miRNA靶標基因序列導(dǎo)入Blastx中，與NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫已經(jīng)收錄的蛋白質(zhì)序列進行比對得到序列相似性較高的蛋白質(zhì)序列，并根據(jù)該已知蛋白質(zhì)的功能注釋分析靶標基因的功能，從而得到靶基因的功能信息，并對靶基因進行分類。

1.4 柞蠶脂肪體總RNA提取及cDNA合成

將ApNPV接種在柞蠶蛹脂肪體內(nèi)，收集已發(fā)病的脂肪體組織，放入液氮中研成粉末，參照miRNeasy Mini Kit試劑盒（TaKaRa公司）說明書進行柞蠶脂肪體總RNA的提取，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒（TaKaRa公司）進行反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，過程參照說明書進行。

1.5 預(yù)測得到的前體序列的檢測

利用前體序列設(shè)計上下游引物，以脂肪體總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，5s rRNA為內(nèi)參，進行反轉(zhuǎn)錄PCR檢測。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性1 min；94 ℃變性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)。

將PCR電泳條帶回收，制備陽性克隆并進行基因測序，將預(yù)測的序列信息與測序結(jié)果進行比對。

1.6 miRNA的表達分析

根據(jù)預(yù)測所得miRNA MD217序列設(shè)計上游引物（F-5′-TTGTGCTTGAAAAACGTAATCTATT-3′）；以SYBR primeScript miRNA RT-PCR kit 試劑盒的通用引物為下游引物（R-5′-GTTTTTCAAGAATGGCTGTACTCGA-3′），以柞蠶蛹脂肪體總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用TP900實時熒光定量PCR儀，進行實時定量分析。

1.7 VmiRNA靶基因表達分析

根據(jù)預(yù)測得到的靶基因MAPKK7序列設(shè)計引物（F-5′-TGCTTCCGAGAAACGTAAGG-3′；R-5′-GTTCTTGTTCCTGATGTGGATTT-3′），以柞蠶蛹脂肪體總RNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板，以β-Actin 作為內(nèi)參，進行實時定量PCR檢測，反應(yīng)條件：95 ℃變性30 s；95 ℃退火5 s；60 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)，每組數(shù)據(jù)重復(fù)3次。并與miRNA的實時定量PCR結(jié)果進行同步對比。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)測得到的VmiRNA前體序列及其二級結(jié)構(gòu)特征 在Vmir Viewer中設(shè)置發(fā)夾結(jié)構(gòu)大于150 nt，長度70～165 bp，得到正鏈上的5個VmiRNA。應(yīng)用RNAfold分析這些VmiRNA分子前體序列二級結(jié)構(gòu)，這些預(yù)測得到的二級結(jié)構(gòu)均含有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，最小折疊自由能為-23～-60 kJ/mol的有3個VmiRNA，平均值為-33.97 kJ/mol（表1）。

通過與測序結(jié)果進行對比分析，利用RNAshapes得到VmiRNA的二級結(jié)構(gòu)，主要依據(jù)二級結(jié)構(gòu)不同區(qū)域序列保守性的變化、5′端首個堿基U的存在、內(nèi)部環(huán)和泡狀區(qū)域的對稱性、miRNA序列與末端環(huán)之間（2～9 nt）的保守性互補堿基對等篩選出VmiRNA MD217（圖1），并利用MD217進行后續(xù)試驗。

2.2 miRNA前體序列MD217的鑒定

以預(yù)測得到的MD217前體序列及成熟體序列為基礎(chǔ)設(shè)計引物，對已經(jīng)被ApNPV感染的柞蠶脂肪體組織的RNA進行PCR擴增。在2%瓊脂糖凝膠電泳中鑒定PCR產(chǎn)物，得到與預(yù)測的VmiRNA前體MD217分子量相符合的條帶（圖2）。將回收產(chǎn)物測序，經(jīng)過與ApNPV基因組序列比對，得到的結(jié)果一致，推測這條序列就是ApNPV編碼的VmiRNA MD217前體序列。

2.3 VmiRNA MD217的靶標基因預(yù)測及表達分析

運用RNAhybrid軟件對成熟VmiRNA MD217的宿主靶標基因進行預(yù)測，結(jié)果找到多個靶標基因，這些靶標基因主要有14種（圖3），分為細胞組成、細胞過程等方面，參與細胞內(nèi)免疫系統(tǒng)、分析結(jié)合、酶催化反應(yīng)等過程。其中，與免疫系統(tǒng)相關(guān)的有6個（表2），主要參與免疫調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答等過程。

利用實時定量PCR的相對定量法分析預(yù)測得到的MD217成熟體及靶基因MAPKK7的表達情況（圖4）。由圖4可以看出，miRNA MD217在感染ApNPV后3 h表達量明顯上升到最高，達25.06，而到了6 h時明顯下降，并隨著時間增加而逐漸減低；靶基因的表達水平與MD217的表達呈正相關(guān)。說明MD217在病毒感染后上調(diào)表達，作用于宿主靶基因后，miRNA上調(diào)了靶基因的表達，當miRNA水平提高時，靶基因水平也提高，隨著miRNA水平的降低，靶基因的表達水平也降低了。

3 討論

病毒miRNA（VmiRNA）是近年來被發(fā)現(xiàn)的一類由病毒及其宿主共同產(chǎn)生的分子，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了超過200個VmiRNA。研究表明，病毒利用這些miRNA控制細胞和病毒基因的表達，病毒性感染對細胞miRNA表達譜有重要影響，而miRNA也可以增強它們的復(fù)制潛力[13]。

該研究通過Vmir預(yù)測篩選獲得了ApNPV基因組編碼的miRNA MD217前體序列，經(jīng)過一系列試驗驗證結(jié)果與預(yù)期符合；對MD217成熟體序列及其作用的宿主靶標基因進行了功能預(yù)測，利用實時定量PCR實時監(jiān)測MD217和其靶標基因MAPKK7的表達水平，通過Ct差值法對相對表達量進行了分析，結(jié)果顯示在3 h后MD217的相對表達量隨時間增加而逐漸降低。miRNA MD217在病毒感染后誘導(dǎo)表達，很可能是降低了宿主免疫系統(tǒng)的防御能力，并同時影響靶基因MAPKK7的功能表達，從而避免了在免疫應(yīng)答過程中的免疫清除。

促絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)途徑是一類在真核生物中廣泛存在的重要的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)。經(jīng)典的 MAPK 級聯(lián)途徑包括3個必需的激酶組分：MAPKKK、MAPKK和 MAPK，通過順序磷酸化而發(fā)揮功能[14]。李國奇等[15]認為，MAPK信號傳導(dǎo)通路是廣泛存在于哺乳動物及植物體內(nèi)的重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，其接受多種多樣的生物刺激，通過多級級聯(lián)式傳導(dǎo)程序引發(fā)細胞的生長、繁殖、分裂、凋亡等生理過程，同時參與炎癥、腫瘤等病理過程。他們的研究表明，MAPKK7 是腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移的抑制因素，關(guān)于MAPKK7 的進一步研究很可能推導(dǎo)出新的腫瘤診治措施。虞朝輝[16]運用miRNA表達譜技術(shù)對小鼠肝臟缺血的研究表明，miR-370可能通過影響潛在靶標基因MAPKK3和MAPKK7的表達，進一步調(diào)節(jié)MAPK信號傳導(dǎo)通路的信號分子，由此在肝臟I/R損傷和IPC中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。筆者在ApNPV上取得的數(shù)據(jù)與MAPK在植物和人體上的結(jié)論有相關(guān)性，同時也將豐富MAPK信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的研究。

越來越多的研究表明，miRNA參與對病毒侵染免疫反應(yīng)的調(diào)控過程。不同昆蟲及細胞感染不同病毒后，其miRNA表達譜多會發(fā)生顯著變化，如棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）幼蟲[17]和草地貪夜蛾Sf9細胞[18]感染桿狀病毒、家蠶幼蟲感染質(zhì)型多角體病毒（BmCPV）[19-20]等，它們miRNA表達譜的變化可能來自寄主本身的抗病毒反應(yīng)，亦可能受病毒基因的調(diào)控而產(chǎn)生。

綜上所述，病毒除了通過自身的一些基因與宿主發(fā)生相互作用外，亦可通過編碼一些VmiRNA與宿主發(fā)生相互作用，通過VmiRNA調(diào)節(jié)宿主體內(nèi)某些相關(guān)基因以及自身相關(guān)基因的表達，為病毒在宿主內(nèi)的存在創(chuàng)造有利的生存環(huán)境。隨著對ApNPV和miRNA的進一步探索，將全面地了解柞蠶和ApNPV之間的作用關(guān)系，并以此制訂更好的柞蠶膿病防御措施。

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