動(dòng)物制品中磺胺類藥物殘留便捷式檢測技術(shù)研究

謝體波　張凱　何方洋

摘要[目的]研究動(dòng)物制品中磺胺類藥物殘留的便捷式檢測技術(shù)。[方法]比較ELISA法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法檢測動(dòng)物制品中磺胺類藥物的殘留。[結(jié)果]利用ELISA法檢測磺胺類藥物殘留具有操作簡便、成本低廉、檢測速率快、檢測時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。[結(jié)論]ELISA法能更符合快速檢測的要求，滿足對肉制品中磺胺類藥物快速檢測。

關(guān)鍵詞動(dòng)物制品；磺胺類藥物殘留；便捷式檢測；ELISA

中圖分類號(hào)S851.34+7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2018）08-0161-03

Convenient Detection Technology of Sulfonamides Residues in the Foods of Animal Products

XIE Tibo1，ZHANG Kai1，HE Fangyang2 et al（1.Guizhou Kwinbon Food Safety ScienceTechnology Co.，Ltd.，Guiyang，Guizhou 550009；2.Beijing Qinbang Biotechnology Co.，Ltd.，Beijing 100012）

Abstract[Objective]To study the convenient detection technology of sulfonamides residues in the foods of animal products.[Method]To compare the technology of ELISA，capillary electrophoresis and high performance liquid chromatography for detecting the sulfonamides residues in the foods of animal products.[Result]Using ELISA method to detect sulfonamides residues has advantages of easy operating， low cost， fast rate and short time.[Conclusion]ELISA can better meet the requirements of rapid detection and meet the rapid detection of sulfonamides in meat products.

Key wordsAnimal products；Sulfonamides residues；Convenient detection；ELISA

基金項(xiàng)目磺胺類、阿維菌素類藥物快速檢測技術(shù)開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目；技術(shù)中心創(chuàng)新能力建設(shè)項(xiàng)目（20170002）；慢抗快速檢測試劑盒產(chǎn)業(yè)化。

作者簡介謝體波（1985—），男，貴州遵義人，工程師，碩士，從事食品安全快速檢測研究。*通訊作者，從事食品安全生物技術(shù)研究。

收稿日期2017-12-11

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是一種化學(xué)合成的兩性化合物，能抑制干擾大多數(shù)革蘭氏陽性菌和某些陰性菌[1]，在醫(yī)學(xué)和多種動(dòng)物的感染性疾病防治中應(yīng)用較為廣泛，有數(shù)十種具有很好的療效[2-4]。但其可殘留于動(dòng)物機(jī)體之中，人體攝入后，當(dāng)其濃度超過峰值時(shí)，將對人體泌尿系統(tǒng)造成破壞，導(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生或菌失調(diào)等癥狀，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)產(chǎn)生過敏及致癌性作用[5-9]。因此，如何合理又快速地檢測畜禽肉質(zhì)品種的磺胺類藥物，保證食品安全變得尤為重要。在國際規(guī)定的畜禽類食品中總磺胺以及單個(gè)磺胺的最高殘留限量為0.100 mg/kg，其中磺胺二甲基嘧啶的最高殘留限量為0.025 mg/kg[10-11]。

目前檢測磺胺類獸藥殘留的方法有很多，如高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜（gas chromatography，GC）、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）、Barham 法等[12-17]，但上述方法由于試驗(yàn)前處理繁瑣，試驗(yàn)設(shè)備操作復(fù)雜，因而不適應(yīng)大規(guī)模的檢查和現(xiàn)場監(jiān)控，從而影響食品安全檢測速率。

該研究中相關(guān)檢測產(chǎn)品與上述儀器相比具有簡便、快速、靈敏度高、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，能最大限度地減少工作時(shí)間和操作誤差，可檢測動(dòng)物性食品中磺胺類藥物殘留量。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試劑。

乙腈、乙酸乙酯、正己烷、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸氫二鈉、去離子水。

1.1.2主要儀器。微孔板酶標(biāo)儀 450 nm/630 nm，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，均質(zhì)器，振蕩器，渦旋儀，離心機(jī)，天平（感量0.01 g），刻度移液管，洗耳球，500 mL 容量瓶，10 mL 玻璃試管，2、50 mL 聚苯乙烯離心管，微量移液器。

1.1.3試劑盒提供材料與試劑。

96孔酶標(biāo)板1塊（包被有偶聯(lián)抗原），0、1、3、9、27、81 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品6瓶（1 mL/瓶），1 μg/mL高濃度標(biāo)準(zhǔn)液1瓶（1 mL/瓶），7 mL 抗體工作液，7 mL 底物液A液，7 mL底物液B液，12 mL酶標(biāo)二抗，2倍濃縮復(fù)溶液 20 mL，20倍濃縮洗滌液40 mL，終止液7 mL。

1.1.4

配制溶液。

配液1：乙腈-乙酸乙酯溶液，量取25 mL 乙腈和25 mL 乙酸乙酯加至50 mL 容量瓶中，混勻；配液2：0.18 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，

稱取23.22 g 十二水合磷酸氫二鈉和3.91 g 二水合磷酸二氫鈉，加入500 mL 去離子水溶解混勻；

配液3：0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，稱取25.80 g 十二水合磷酸氫二鈉和4.35 g 二水合磷酸二氫鈉，加入500 mL 去離子水溶解混勻；

配液4：復(fù)溶工作液，

用去離子水將濃縮復(fù)溶液按1∶1體積稀釋，用于樣本復(fù)溶；配液5： 洗滌液，用去離子水將20倍濃縮洗滌液稀釋（1 mL 20倍濃縮洗滌液+19 mL去離子水），用于酶標(biāo)板的洗滌。

1.2檢測方法

1.2.1原理。該研究采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，讓原有樣本中所殘留的磺胺類藥物與酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包裝偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺類藥物的抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物使其顯色，樣本吸光度值與其所含殘留物磺胺類藥物的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，就可以得出磺胺類藥物的殘留量。

1.2.2組織樣本前處理。

①稱取1 g均質(zhì)后的雞肉或豬肉組織樣本到50 mL 聚苯乙烯離心管中，加入0.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，用渦旋儀渦動(dòng)樣本成糊狀，加入7 mL 乙腈-乙酸乙酯溶液，振蕩均勻。當(dāng)樣本組織溶液超過3 kg時(shí)，應(yīng)保持20～25 ℃離心5 min。②移取2 mL 上層有機(jī)液至10 mL潔凈干燥玻璃試管中，于50～60 ℃ 水浴氮?dú)饬飨麓蹈伞?/p>

③加入0.5 mL 正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)30 s溶解干燥的殘留物，再加入0.5 mL 復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動(dòng)30 s，混勻，轉(zhuǎn)入2 mL 聚苯乙烯離心管中。④除去上層有機(jī)相，取下層水相25 μL 用于分析。

1.2.3操作步驟。

①將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，使其回溫至室溫（20～25 ℃），每種試劑在使用之前都要搖勻。

②取出微孔板，將豬肉或雞肉樣本和標(biāo)準(zhǔn)品按對應(yīng)微孔序列排序，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

③加標(biāo)準(zhǔn)品和樣本25 μL到編號(hào)所相對的微孔中，然后加入25 μL/孔抗體工作液，輕輕搖晃混合，蓋上膜蓋板后置25 ℃，在避光環(huán)境中反應(yīng)30 min。

④將孔內(nèi)的液體甩干，加入洗滌工作液200 μL/孔，反復(fù)洗滌3～4次，每次間隔8 s，用吸水紙拍干。

⑤加入酶標(biāo)二抗50 μL/孔，輕輕振蕩混合，在25 ℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min，然后重復(fù)步驟④。

⑥加入底物液A液25 μL/孔，再加入底物液B液25 μL/孔，輕輕振蕩混合，蓋膜蓋板后置25 ℃避光環(huán)境反應(yīng)15 min，最終使其有顯色反應(yīng)。⑦加入終止液25 μL/孔，輕輕混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于630 nm處，測定每孔OD值。

1.2.4試劑盒其余指標(biāo)檢測方法。

依次對試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)性、特異性、靈敏度、精密度進(jìn)行研究，并將其中的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度與高效液相色譜檢測的相關(guān)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)性進(jìn)行對比。

1.2.5磺胺類藥物殘留定量分析。

樣本或標(biāo)準(zhǔn)品吸光率百分比等于樣本或標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的平均值除以第1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值的平均值，再乘以100%，即

百分吸光率=B/B0×100%

式中，B為標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液的平均吸光度值；B0為0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值。

由于標(biāo)準(zhǔn)品吸光率的變化，以標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值為縱坐標(biāo)，磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，帶入百分比吸光率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得出樣本對應(yīng)的濃度值，再乘以樣本稀釋的倍數(shù)，即為磺胺類藥物的真實(shí)濃度。其中組織樣本稀釋1倍，畜禽肉樣本稀釋倍數(shù)為4倍。

1.2.6試劑準(zhǔn)確度和精密度的測定。準(zhǔn)確度是指測定值與實(shí)際值間的符合程度，通常用回收率表示。精密度是反映檢測方法對某一固定樣品多次測定所得的重復(fù)程度，又稱為重復(fù)性，這也是評定化學(xué)發(fā)光試劑盒質(zhì)量的基本參數(shù)。在此次測定范圍中，就通過測定樣品中的相應(yīng)參數(shù)來判斷該試劑盒與其他檢測手段的區(qū)別。

1.2.7研究其他藥物的交叉反應(yīng)率。

交叉反應(yīng)率是指不同結(jié)構(gòu)的抗原定性簇與抗體結(jié)合的能力。選擇磺胺甲基異噁唑作為相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，按上述操作步驟，加入不同類的磺胺類競爭物，以試驗(yàn)所得化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度值，計(jì)算抑制百分比，制作相應(yīng)的百分曲線，通過抑制濃度，計(jì)算競爭物的交叉反應(yīng)率。

1.3注意事項(xiàng)

①當(dāng)室溫低于20 ℃或試劑及樣本未回到室溫，可能導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值偏低。

②此次使用的終止液為2 mol/L硫酸，操作時(shí)禁止與皮膚接觸。

③在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)曲線不呈線性、重復(fù)性不好，所以將洗板抖干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

④當(dāng)加入底物液A液和B液時(shí)，顯色時(shí)間通常為12～15 min。⑤每加1種試劑前需要將其搖勻。⑥該試劑應(yīng)儲(chǔ)存在2～8 ℃ 環(huán)境中，禁止冷凍并避免直接暴露在光線下。⑦發(fā)色試劑有任何顏色變化表示其已變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。

2結(jié)果與分析

2.1反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

使用上述方法加入與之對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品和抗體，室溫下反應(yīng)4、8、12、16 min后加入發(fā)光溶液，最終結(jié)果表明反應(yīng)時(shí)間為12 min時(shí)，發(fā)光值最大（圖1）。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線

以磺胺甲基異噁唑標(biāo)準(zhǔn)品濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，百分發(fā)光率為縱坐標(biāo)，繪制抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

從圖2得到曲線線性方程y=-16.748x+85.442，R2=0.985 6，其中y為百分發(fā)光率，x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（C）對數(shù)。運(yùn)用專業(yè)分析軟件替換相應(yīng)橫坐標(biāo)，所得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線見圖3，根據(jù)圖3相應(yīng)數(shù)據(jù)得出試劑盒在1.0～81.0 ng/mL線性范圍內(nèi)關(guān)系良好。

對空白豬肉做20次試驗(yàn)，采用試驗(yàn)結(jié)果平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差的方法檢測出最低檢出限，根據(jù)公式計(jì)算出該試劑盒豬肉最低檢出限為0.93 μg/kg。

2.3試劑特異性的確定

選擇5種磺胺類藥物（磺胺甲基異噁唑、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑），計(jì)算出交叉反應(yīng)率，結(jié)果表明交叉反應(yīng)率都較高，所以該試劑盒適用于檢測以上5種藥物，并能更好地表示所檢測數(shù)據(jù)的特異性。

2.4準(zhǔn)確度與精密度的測定

ELISA法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法[20]通常以回收率表示準(zhǔn)確度，以變異系數(shù)表示精密度。從表2～4可以看出，取空白豬肉樣本，分別添加磺胺甲基異噁唑標(biāo)準(zhǔn)品

磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲噻二唑至1、2 μg/kg，比較各個(gè)方法之間的差別。

3結(jié)論

我國對磺胺類藥物在動(dòng)物制品中的殘留限量有著明確規(guī)定，然而在檢測中大部分操作方法都面臨耗時(shí)長、成本高等問題。該研究對快速檢測磺胺類藥物殘留的3種方法進(jìn)行對比，驗(yàn)證ELISA法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法對檢測磺胺類藥物準(zhǔn)確度與靈敏度之間的差異。在研究中發(fā)現(xiàn)ELISA法對磺胺類藥物抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，在試驗(yàn)過程中5種磺胺類藥物交叉反應(yīng)率高，且試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍廣，最低檢測限為0.93 μg/kg，ELISA試劑盒法添加回收率為90.7%～101.0%，變異系數(shù)為0.4%～5.9%；毛細(xì)管電泳法添加回收率為84.2%～102.0%，變異系數(shù)為0.8%～7.2%；高效液相色譜法添加回收率為83.0%～97.3%，變異系數(shù)為3.4%～10.8%。由此可以看出，ELISA試劑盒法的準(zhǔn)確度與精密度均高于毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜法。該方法不僅滿足國家規(guī)定的各項(xiàng)檢測指標(biāo)，而且與毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法相比時(shí)間縮短，符合分析周期短，樣品前處理簡單、迅速、靈敏的檢測要求?？梢娪肊LISA法以及提供的試劑更符合快速檢測的要求，能滿足對肉制品中磺胺類藥物快速檢測。

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