全自動(dòng)固相萃取—超高效液相色譜法快速測(cè)定食品中米酵菌酸含量

周霞　陳萬(wàn)勤　傅紅雪

摘要[目的]建立混合型強(qiáng)陰離子（MAX）全自動(dòng)固相萃取富集凈化，超高效液相色譜法快速檢測(cè)食品中米酵菌酸殘留量的方法。[方法]采用C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇和1%乙酸為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為267 nm。[結(jié)果]米酵菌酸在0.1～40.0 mg/L線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999 9?？疾鞓悠返奶崛l件及不同固相萃取小柱的凈化效果表明，選擇80%乙腈溶液（含2%氨水）為提取溶劑，超聲提取30 min，MAX小柱富集凈化，效果最佳。方法檢出限為2.5 μg/kg，平均回收率為90.11%～96.54%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.05%。[結(jié)論]采用自動(dòng)固相萃取儀，使得前處理簡(jiǎn)單快速、重復(fù)性好，方法學(xué)驗(yàn)證表明該方法精確靈敏、回收率高，適用于食品中米酵菌酸殘留量的快速測(cè)定。

關(guān)鍵詞米酵菌酸；食品；超高效液相色譜；混合陰離子全自動(dòng)固相萃取

中圖分類(lèi)號(hào)TS207文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2018）08-0159-02

Fast Determination of Bongkrekic Acid in Food by Auto Solid Phase Extractionultra High Performance Liquid Chromatography

ZHOU Xia，CHEN Wanqin，F(xiàn)U Hongxue et al（Zhejiang Institution of Food and Drug Control， Hangzhou，Zhejiang 310052）

Abstract[Objective] The research aimed to establish a mixedmode anion exchange （MAX） auto solid phase extraction （SPE） purification and ultrahigh performance liquid phase chromatography for the rapid determination of bongkrekic acid （BKA） in food.[Method]Using a C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm），with methanol and 1% acetic acid as mobile phase，the detection wavelength was 267 nm.[Result]BKA had a good linearity between the concentration range of 0.1-40.0 mg/L， the correlation coefficient was more than 0.999 9.The extraction conditions of the samples and the purification effects of different solid phase extraction cartridges showed that the optimum conditions were as follows： 80% acetonitrile solution （containing 2% ammonia） as the extraction solvent and ultrasonic extraction for 30 min， MAX column enrichment purification， the best effect.The detection limit was 2.5 μg/kg. The average recovery was 90.11% - 96.54%. The relative standard deviation was 3.05%.[Conclusion]SPE makes the pretreatment simple， rapid and reproducible. The methodological verification shows that the method is accurate，sensitive and has high recovery rate. It is suitable for the rapid determination of the acid residues in BKA in food.

Key wordsBongkrekic acid （BKA）；Food；Ultra high performance liquid chromatography；MAX auto solid phase extraction

作者簡(jiǎn)介周霞（1990—），女，浙江仙居人，藥師，碩士，從事食品分析、藥物分析研究。*通訊作者，主任藥師，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事食品分析、藥物分析研究。

收稿日期2017-12-08

米酵菌酸（Bongkrekic acid，BKA）是一種脂溶性酸性化合物，分子式為C28H38O7，相對(duì)分子質(zhì)量為486.6[1]，是椰毒假單胞菌酵米面亞種代謝物中的一種[2-3]，它存在于發(fā)酵食品、變質(zhì)銀耳等食物中，毒性較強(qiáng)，食用者會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、抽搐、休克等中毒癥狀，損傷肝、腦神經(jīng)細(xì)胞以及腎臟組織[4-5]，在我國(guó)引起多起食物中毒事件，需嚴(yán)加防范。目前米酵菌酸的檢測(cè)方法較少，但是近年來(lái)許多學(xué)者對(duì)米酵菌酸的生物合成及其在細(xì)胞凋亡、損傷等方面開(kāi)展了研究[6-11]，并且發(fā)現(xiàn)米酵菌酸對(duì)細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔有抑制作用。米酵菌酸的檢測(cè)方法主要有液相色譜法、波層色譜法、紫外分光光度法以及液質(zhì)聯(lián)用法。現(xiàn)有方法前處理方法周期長(zhǎng)、有機(jī)試劑消耗量大、回收率低，不適用于批量樣品的檢測(cè)分析。該試驗(yàn)基于現(xiàn)有米酵菌酸檢測(cè)的不足，建立了混合強(qiáng)陰離子交換柱全自動(dòng)固相萃取-液相色譜測(cè)定食品中米酵菌酸殘留量的方法，以期為實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展相關(guān)檢測(cè)提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑玉米面、銀耳等樣品采集于市場(chǎng)。米酵菌酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度95%），SIGMA公司；乙酸、甲酸、乙腈、甲醇均為色譜純；氨水等均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備Thermo U3000 （配有DAD檢測(cè)器）超高效液相色譜法，美國(guó)Thermo公司；Fotector plus 全自動(dòng)固相萃取儀，美國(guó)Reeko公司；Milli-Q超純水器，美國(guó)Millipore公司；Multifuge X1高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；KH-500DV超聲儀，昆山永創(chuàng)超聲儀器有限公司；QT-1渦旋混合器，上海琪特分析儀器有限公司；Waters固相萃取裝置，美國(guó)Waters公司；XPE205電子天平，瑞士公司。

1.3方法

1.3.1色譜條件。色譜柱為Waters SunFire C18（250 mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-1%乙酸水（75∶25，V/V）；柱溫35 ℃；波長(zhǎng)267 nm；進(jìn)樣量50 μL。

1.3.2樣品前處理。

干試樣經(jīng)粉碎后，稱(chēng)取20 g（精確至0.01 g）置于錐形瓶中，加入40 mL 80%乙腈水溶液（含2%氨水），混勻，室溫下避光浸泡1 h，置于超聲波振蕩器中超聲提取約30 min ，低速離心。轉(zhuǎn)移上清液，在殘?jiān)屑尤?0 mL甲醇溶液（含 2%氨水），重復(fù)上述操作一次，合并上清液，待凈化。采用全自動(dòng)固相萃取儀進(jìn)行程序洗脫，使用Waters Oasis MAX 6cc（500 mg）陰離子交換柱[12]，富集洗脫程序時(shí)間如表1所示，對(duì)80 mL提取溶液進(jìn)行凈化富集。

經(jīng)全自動(dòng)固相萃取儀富集凈化，對(duì)洗脫液進(jìn)行收集，于40 ℃水浴中氮吹至干，然后加入1.0 mL甲醇，渦旋溶解，混勻，經(jīng)微孔有機(jī)濾膜過(guò)濾后進(jìn)行HPLC分析。

2結(jié)果與分析

2.1提取溶劑優(yōu)化

米酵菌酸是一種脂溶性的極性化合物，該試驗(yàn)探索了不同比例的乙腈溶液和甲醇溶液對(duì)米酵菌酸提取效率的影響。樣品經(jīng)不同溶劑提取后，取離心后上清液氮吹濃縮后，過(guò)MAX固相萃取柱凈化后，濃縮上機(jī)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80%乙腈水溶液的提取效果最佳，而且100%甲醇或乙腈的過(guò)柱效率低，耗時(shí)長(zhǎng)。因?yàn)槊捉途岱肿咏Y(jié)構(gòu)中含有3個(gè)羧基，在堿性環(huán)境下能夠解離出氫離子而帶一部分負(fù)電荷，易溶于有機(jī)溶劑中，在80%乙腈水溶液中加入一定量的氨水，可以提高過(guò)柱的效率。該試驗(yàn)選擇體積分?jǐn)?shù)為80%的乙腈水溶液（含2%氨水）作為提取液。

2.2超聲時(shí)間優(yōu)化

超聲提取具有提取效率高、時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[1]，已成為近年來(lái)應(yīng)用最廣泛的食品提取方式之一。該試驗(yàn)考察了超聲提取時(shí)間對(duì)米酵菌酸提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)30 min時(shí)提取效果最佳，與文獻(xiàn)[1]中報(bào)道一致。

2.3固相萃取柱優(yōu)化

選擇C18、Prime柱及MAX等固相萃取小柱進(jìn)行。樣品經(jīng)優(yōu)化后的溶液超聲提取、離心后等到上清液，分別經(jīng)C18、Prime、WAX及MAX固相萃取小柱凈化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C18、Prime柱對(duì)該溶液提取下的米酵菌酸并無(wú)保留。WAX的使用方法是先用酸化的試劑進(jìn)行清洗后再用堿化試劑洗脫，“2.1”研究發(fā)現(xiàn)在提取實(shí)際中加入一定量的堿性物質(zhì)氨水有利于提高提取效率，故不采用WAX固相萃取柱。米酵菌酸為酸性化合物，可與MAX柱進(jìn)行離子交換而被保留，從而起到了富集凈化的目的，最后由酸性溶液將目標(biāo)化合物洗脫。

2.4流動(dòng)相優(yōu)化

因?yàn)槊捉途岬乃嵝暂^強(qiáng)，流動(dòng)相的pH對(duì)其保留行為影響較大，當(dāng)流動(dòng)相條件為酸性時(shí)可避免離子化，從而得到良好峰形。該試驗(yàn)考察不同比例甲酸、乙酸對(duì)保留行為的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用甲酸作為流動(dòng)相時(shí)，出峰較乙酸靠后，存在一定的峰展寬?？疾觳煌壤囊宜崛芤喊l(fā)現(xiàn)，隨著乙酸濃度的升高，柱效提高，考慮到柱子的耐受性，選擇1%乙酸水溶液和甲醇作為流動(dòng)相。

2.5方法回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果

按照“1.3.2”項(xiàng)下的前處理方法，選擇不含米酵菌酸的玉米面和銀耳進(jìn)行6個(gè)水平的加標(biāo)回收率試驗(yàn)，每個(gè)水平進(jìn)行6個(gè)平行測(cè)定。從表2可看出，2種樣品平均加標(biāo)回收率在90.11%～96.54%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.05%。該方法學(xué)驗(yàn)證說(shuō)明該方法適用于食品中米酵菌酸的含量測(cè)定，檢出限（S/N≥3）為0.002 5 mg/kg。米酵菌酸在0.1～40.0 mg/L 線性良好，相關(guān)系數(shù)r值大于0.999 9。

3結(jié)論

該試驗(yàn)建立了基于混合型強(qiáng)陰離子全自動(dòng)固相萃取-超高效液相色譜快速測(cè)定食品中米酵菌酸含量的方法。采用了全自動(dòng)固相萃取儀代替了傳統(tǒng)的人工過(guò)柱的方法[13]，實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，減少了人力成本，減少了人為誤差，實(shí)現(xiàn)了固相萃取流速的可控性，提高了試驗(yàn)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性，縮短了樣品處理周期，該方法對(duì)提取條件、色譜條件等進(jìn)行了優(yōu)化，得到了良好的分離度和色譜峰，靈敏度高，回收率高，前處理周期較短，滿足了食品中米酵菌酸含量的檢測(cè)要求，為實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展相關(guān)檢測(cè)提供參考依據(jù)，為保障食品安全發(fā)揮積極作用。

參考文獻(xiàn)

[1]

李紅艷，金燕飛，黃海智，等.高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器結(jié)合固相萃取法快速測(cè)定食品中米酵菌酸殘留[J].食品科學(xué)，2016，37（24）：247-251.

[2] 蘇肯明，梁達(dá)清.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定銀耳中的米酵菌酸[J].廣東化工，2014，41（16）：168-169.

[3] 周鵬.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定銀耳中米酵菌酸[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2015，36（22）：123-126.

[4] 宋興田，吳洪娟，莊寶祥.米酵菌酸中毒小鼠肝和腦組織的形態(tài)學(xué)改變[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，7（26）：36-38.

[5] 宋興田，吳洪娟，莊寶祥，等.米酵菌酸對(duì)小鼠腎組織毒性作用的超微結(jié)構(gòu)觀察[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2010，7（24）：145-146.

[6] OKUDA K，HASUI K，ABE M，et al.Molecular design， synthesis， and evaluation of novel potent apoptosis inhibitors inspired frombongkrekic acid[J].Chemical research in toxicology，2012，25（10）：2253-2260.