貴州都勻馬尾松1.5代種子園交配系統(tǒng)分析

何可權(quán)　邵苗苗　趙楊

摘要利用 SSR 分子標(biāo)記對都勻馬寨馬尾松 1.5 代無性系種子園交配系統(tǒng)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，無性系種子園的多位點(diǎn)異交率 tm=1.000（SD=0.000），單位點(diǎn)異交率 ts=0.996（SD=0.001），雙親近交比tm-ts=0.004（SD=0.000），tm 與 ts 值之間的差值反映雙親近交程度，tm-ts=0.004 接近0，表明馬尾松 1.5 代種子園交配系統(tǒng)以異交為主。

關(guān)鍵詞馬尾松；種子園；SSR；交配系統(tǒng)

中圖分類號S791.248文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2018）08-0123-02

Analysis on Mating System of 1.5 Generation Seed Orchard of Pinus massoniana in Duyun，Guizhou

HE Kequan1， SHAO Miaomiao2，ZHAO Yang2 et al

（1. Dushan State Forest Farm， Dushan ，Guizhou 558200；2.College of Forestry， Guizhou University，Guiyang， Guizhou 550025）

AbstractUsing SSR molecular marker to analyze the mating system of 1.5 generation seed orchard of Pinus massoniana in Duyun Guizhou. The results showed that the multilocus outcrossing rate tm was 1.000 （SD = 0.000）， the singlelocus outcrossing rate ts was 0.996 （SD=0.001）， inbreeding parents tmts was 0.004 （SD=0.000）， the difference between tm and ts reflected the parents inbreeding extent， tmts was 0.004 and it was close to zero， which indicated that most of the mating system of 1.5 generation seed orchard of P. massoniana seed orchard was based on outcrossing.

Key wordsPinus massoniana；Seed orchard；SSR；Mating system

基金項(xiàng)目貴州省重大科技專項(xiàng)（黔科合重大專項(xiàng)字〔2012〕6011號）；貴州大學(xué)引進(jìn)人才科研項(xiàng)目（2012-031）。

作者簡介何可權(quán)（1972—），男，貴州獨(dú)山人，工程師，從事林木良種繁育與栽培研究。*通訊作者，教授，博士，從事林木良種繁育與栽培研究。

收稿日期2017-12-16

馬尾松（Pinus manssoniana Lamb.）系松科松屬常綠喬木，馬尾松分布廣，生長迅速，適應(yīng)性強(qiáng)，用途廣泛，是我國南方地區(qū)主要的造林樹種。種子園是馬尾松主要的良種繁育基地，是育種系統(tǒng)中不可缺少的組成部分。交配系統(tǒng)是指生物有性繁殖過程中配子結(jié)合類型、模式、影響因素和機(jī)制的狀態(tài)反應(yīng)，包含傳粉受精的全部過程，異交率是交配系統(tǒng)的特征參數(shù)。張薇等[1]用 SSR 分子標(biāo)記對福建白砂林場馬尾松實(shí)生種子園進(jìn)行交配系統(tǒng)分析，該種子園異交率較高，不同冠層和方位上的異交率不同，與其花量調(diào)查的結(jié)果相吻合。林木種子園是生產(chǎn)高質(zhì)量種子的基地，林木種子園種子的遺傳增益不僅取決于建園親本的遺傳特性，而且還與整個(gè)種子園交配系統(tǒng)密切相關(guān)[2-3]。貴州省作為馬尾松重要分布區(qū)之一，具有獨(dú)特的位置和地理?xiàng)l件，孕育遺傳品質(zhì)多樣的馬尾松資源。目前已建立馬尾松種子園4個(gè)，其中國家林木良種基地2個(gè)，均已進(jìn)入結(jié)實(shí)盛期。研究表明，馬尾松自交易衰退，人們也在擔(dān)心這些馬尾松良種基地是否存在著自交、近交情況。因此，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對貴州省都勻馬尾松1.5代種子園交配系統(tǒng)進(jìn)行研究，以期為該種子園經(jīng)營管理提供指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料均來自貴州都勻馬寨馬尾松 1.5 代無性系種子園，該種子園建于 1992 年，位于貴州省都勻市奉合鄉(xiāng)（26°16′ N、107°31′ E），屬中亞熱帶濕潤區(qū)，年平均氣溫 15.8 ℃，最低氣溫-6.9 ℃，≥10 ℃積溫 4 979 ℃，年均降水量 1 423 mm。種子園由48 個(gè)優(yōu)良無性系采用順序錯(cuò)位設(shè)計(jì)配置而成。選擇種子園內(nèi)高產(chǎn)的 10 個(gè)無性系，每個(gè)無性系隨機(jī)選擇 20 個(gè)子代，共 200個(gè)子代，及種子園 48 個(gè)無性系親本，用試劑盒提取這 248 個(gè)樣本的 DNA 低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2引物的篩選和 PCR 擴(kuò)增

從馬尾松上已開發(fā)、使用的 SSR 引物中[1，4-5]，選擇 58 對交由上海生工生物工程股份公司合成。從中篩選出 10對引物用于交配系統(tǒng)分析試驗(yàn)，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在 PTC-200的 PCR 儀上進(jìn)行。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系共20 μL，其中模板DNA 2 μL（約50 ng）、10×buffer 2 μL、上下游引物濃度各10 μmol/L、Tap Polymerase 0.1 U，雙蒸水補(bǔ)齊至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性4 min；55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min；4 ℃保存?zhèn)溆?。瓊脂糖凝膠電泳，采用人工讀帶法，排除模糊不清和無法準(zhǔn)確標(biāo)識的帶。

1.3數(shù)據(jù)分析

異交率的測定有多種方法，F(xiàn)yfe等[6]提出的混合交配模型是最基本的異交率估測模型等，其他學(xué)者基于混合交配模型導(dǎo)出的多個(gè)獨(dú)立位點(diǎn)異交率估測模型是目前最普遍的估測程序[7-9]。運(yùn)用 Ritand 的混合交配系統(tǒng)模型 MLTR 程序估計(jì)固定指數(shù)（F）、單位點(diǎn)異交率 ts、多位點(diǎn)異交率 tm 及其標(biāo)準(zhǔn)差等[8]?；旌辖慌湎到y(tǒng)適用于共顯性標(biāo)記的多位點(diǎn)異交率分析軟件MLTR3.4對馬尾松的 10 個(gè)無性的 200 株幼苗系交配系統(tǒng)參數(shù)分別進(jìn)行估計(jì)。在親本基因型已知的前提下，采用最大期望值法，在 99%的置信區(qū)間（CI = mean ± 1.96×s.e.）下經(jīng)過100 次重復(fù)取樣（bootstraps）分別估計(jì)以下參數(shù)：單位點(diǎn)（ts）和多位點(diǎn)（tm）異交率；雙親近交系數(shù)（tm–ts）；父本相關(guān)性（rp），包括單位點(diǎn)相關(guān)性[rp（s）]和多位點(diǎn)相關(guān)性[rp（m）]。其中 tm-ts 是雙親近交水平的估計(jì)值，數(shù)值越大表明父母本個(gè)體之間親緣關(guān)系越近。

2結(jié)果與分析

2.1種子園整體交配系統(tǒng)參數(shù)

利用MLTR 軟件程序?qū)︸R尾松種子園高產(chǎn)的10 個(gè)無性系200個(gè)單株進(jìn)行分析（表 1）。估算出多位點(diǎn)異交率 tm=1.000（SD=0.000），單位點(diǎn)異交率 ts=0.996（SD=0.001），雙親近交比例tm-ts=0.004（SD=0.000），tm 與 ts 值之間的差值反映雙親近交程度，tm-ts=0.004接近0，說明馬尾松1.5代種子園子代親本的近交現(xiàn)象不顯著，多位點(diǎn)異交率大于單位點(diǎn)異交率。固定指數(shù) F=0.963大于0，表明居群中有過剩的純合子，并且相對異交而言近交很少。

2.210個(gè)家系的交配系統(tǒng)參數(shù)

對種子園10個(gè)高產(chǎn)的無性系分別進(jìn)行交配系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)多位點(diǎn)異交率（tm）相差比較大，變化幅度為0.148～1.000，而單位點(diǎn)異交率（ts）相差不大，變化幅度為0.854～1.000（表2）。不同無性系的交配指數(shù)不同，這與個(gè)體自交可育程度的差異、自身花粉充裕程度以及所處地理環(huán)境有關(guān)。對家系間異交率的差別分析要分清其自交是遺傳因素導(dǎo)致的，還是環(huán)境因素導(dǎo)致的，準(zhǔn)確的結(jié)論可為家系選擇提供幫助。

3結(jié)論與討論

利用SSR分子標(biāo)記對種子園交配系統(tǒng)進(jìn)行分析，估算出多位點(diǎn)異交率tm=1.000（SD=0.000），單位點(diǎn)異交率ts=0.996（SD=0.001），雙親近交比列tm-ts=0.004（SD=0.000），tm與ts值之間的差值反映雙親近交程度，tm-ts=0.004 接近0，說明馬尾松1.5代種子園子代親本的近交現(xiàn)象不顯著，多位點(diǎn)異交率大于單位點(diǎn)異交率。固定指數(shù)F=0.963大于0，表明居群中有過剩的純合子，并且相對異交而言近交很少。對該種子園10個(gè)高產(chǎn)的無性系分別進(jìn)行交配系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)多位點(diǎn)異交率（tm）相差比較大，而單位點(diǎn)異交率（ts）相差不大，不過都處于較高水平，說明該種子園的家系選擇和家系選型配置上比較理想。

交配系統(tǒng)是以種群為研究對象，是群體遺傳學(xué)研究的重點(diǎn)。植物交配系統(tǒng)不僅決定著植物種群的遺傳特征，影響植物物種的進(jìn)化方向與速度，還間接影響地球上其他物種的演化歷程?？梢哉f植物交配系統(tǒng)的進(jìn)化意義關(guān)系到地球上整個(gè)生命界的演變。植物交配系統(tǒng)本身并不是固定不變的而是動(dòng)態(tài)的，受到來自植物本身及周圍各種外界因素的影響，于是植物在異交和自交之間相互轉(zhuǎn)換協(xié)調(diào)，這不僅發(fā)生在種間，同時(shí)也發(fā)生于種下水平，這在進(jìn)化研究中極為重要。異交率作為研究交配系統(tǒng)的重要參數(shù)，在以往的研究表明，松屬樹種具有典型的高異交率。例如：日本柳杉的異交率為 0.944[6]，紅松為 0.966[9]，歐洲赤松為 0.950[10]，北美喬松和扭葉松分別為1.020和 1.000[11]。譚小梅等[12]研究的馬尾松的異交率為 1.098。馮源恒等[13]在廣西馬尾松種子園交配系統(tǒng)動(dòng)態(tài)分析中也發(fā)現(xiàn)馬尾松種子園存在很高的異交率。影響植物異交率的因素有很多，比如株距、散粉授粉時(shí)花粉的數(shù)量及密度，授粉時(shí)風(fēng)力及風(fēng)向、溫度及濕度等情況。不同年份同一種群的異交水平不盡相同，與當(dāng)年的自然環(huán)境因素有很大的關(guān)系。自交親和的物種在種群密度低時(shí)，外源植株提供的有效花粉減少，從而近交和自交的機(jī)會(huì)增多使導(dǎo)致異交率降低；種群密度高時(shí)，相鄰植物間的聯(lián)系加大，異交水平高[14]。馬尾松種子園常存在親本開花結(jié)實(shí)量不均衡，花期不遇等，在春季散粉時(shí)期，要注意觀察天氣情況，適當(dāng)進(jìn)行人工授粉。該種子園目前異交率很高，但該種子園隨著樹體生長擴(kuò)大，林分開始郁閉，也可能會(huì)造成異交率下降，尚需要對種子園進(jìn)行子代測定，對親本進(jìn)行疏伐，選擇優(yōu)良親本進(jìn)行輔助授粉，以保持良好的交配系統(tǒng)，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種子。

參考文獻(xiàn)

[1] 張薇，龔佳，季孔庶.馬尾松實(shí)生種子園交配系統(tǒng)分析[J].林業(yè)科學(xué)，2009，45（6）：22-26.

[2] 楊漢波，張蕊，周志春.木荷種子園的遺傳多樣性和交配系統(tǒng)[J].林業(yè)科學(xué)，2016，52（12）：66-73.

[3] 程祥，張梅，毛建豐，等.有限種群油松種子園的遺傳多樣性與交配系統(tǒng)[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，38（9）：8-15.

[4] 艾暢，徐立安，賴煥林，等.馬尾松種子園的遺傳多樣性與父本分析[J].林業(yè)科學(xué)，2006，42（11）：146-150.

[5] 張冬梅，楊婭，沈熙環(huán)，等.油松 SSR-PCR 引物篩選及反應(yīng)體系的建立[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，29（2）：13-17.

[6] FYFE J L，BAILEY N T J.Plant breeding studies in leguminous forage crops I.Natural crossbreeding in winter beans [J].The journal of agricultural science，1951，41（4）：371-378.