珍稀瀕危植物銀縷梅ISSR—PCR反應體系建立及優(yōu)化

陳云霞　路志遠　肖卓恒

摘要[目的]建立和優(yōu)化銀縷梅ISSR—PCR反應體系。[方法]采用正交試驗和單因子試驗對影響PCR擴增體系中的Mg²⁺濃度、dNTPs模板DNA及引物濃度、Taq酶用量5個因子進行分析研究。[結果]銀縷梅ISSR-PCR25μL反應體系中5個因子最優(yōu)水平：DNA模板（20ng/μL）2.50μL，引物（10μmol/L）1.00μL，Taq酶（5U/μL）0.10μL，Mg²⁺（25mmol/L）3.00μL，dNTPs（2.5mmol/L）1.50μL。[結論]銀縷梅ISSR-PCR反應最優(yōu)體系的建立為進一步利用ISSR對其進行分子標記輔助育種、分子指紋圖譜構建和遺傳多棒性分析等后續(xù)研究奠定了基礎。

關鍵詞 銀縷梅；ISSR；PCR反應體系；資源保護

中圖分類號 S188 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）11-0081-03

銀縷梅（Parrotiasubaequalis）是僅存于我國被再發(fā)現(xiàn)的“活化石”樹種，也是我國特有的單種屬喬木樹種，在植物進化史上有著承前（裸子植物）啟后（被子植物）的重要地位。銀縷梅是一種珍貴的兼具觀花和秋季觀葉的優(yōu)良綠化觀賞樹種。但由于其分布區(qū)狹小，呈間斷島嶼狀散布于天目山北段及大別山東南部，現(xiàn)存種群個體數(shù)量極少，已瀕于滅絕，1999年被列入《國家一級重點保護野生植物名錄》，并被國際自然保護聯(lián)盟（IUCN）列為極度瀕危（criticallyendan-gered，CR）物種。面對如此嚴峻的形勢，對銀縷梅遺傳多樣性的研究與分析，制定更具針對性的種質(zhì)資源保護策略非常迫切。

簡單重復序列區(qū)間擴增（inter-simplesequencerepeats，IS-SR）是在微衛(wèi)星技術基礎上發(fā)展起來的一類分子標記技術。ISsR技術以其多態(tài)性好、成本低、操作簡單、所需DNA模板含量少等特點備受青睞，其在植物種質(zhì)資源收集和鑒定、遺傳多樣性和親緣關系及基因定位等方面被廣泛應用。

近年來針對銀縷梅開展的研究工作雖然比較活躍，但大多數(shù)研究還是集中于形態(tài)解剖、系統(tǒng)分類、生理生態(tài)、生物學特性及繁殖培育等方面，在分子水平的研究幾乎空白。筆者通過正交試驗和單因子試驗，分析模板DNA、Taq酶、引物、Mg²⁺和dNTPs5個因子對銀縷梅ISSR-PCR反應的影響，建立銀縷梅最佳ISSR-PCR反應體系，以期為利用ISSR標記對其進行分子標記輔助育種、分子身份證構建和遺傳多樣性分析等后續(xù)研究奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料 銀縷梅植物材料采自江蘇省宜興林場大垅溝，植物葉片采用硅膠.陜速干燥保存。

1.2方法

1.2.1銀縷梅DNA提取。將0.1g銀縷梅葉片剪碎，先用液氮處理再用研缽研磨粉碎，用DNeasyPlantMiniKit植物基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN公司）提取基因組。使用紫外分光光度法和1%瓊脂糖凝膠電泳法對DNA的濃度和質(zhì)量進行檢測。

1.2.2銀縷梅ISSR-PCR反應引物篩選。從加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的100個ISSR引物中隨機選擇16條引物（805、809、816、821、829、832、834、838、843、845、851、863、869、872、877、880）進行初篩選。初反應體系為25μL，其中Taq酶0.20μL，Mg²⁺2.00μL，DNA2.00μL，dNTPs2.00μL，引物1.00μL，MilliQ水17.80μL。

擴增的程序為95℃預變性10min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸2min，共36個循環(huán)；72℃延伸10min，使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3銀縷梅ISSR-PCR反應體系建立。對銀縷梅IssR反應5因素（Taq酶、Mg²⁺、DNA、dNTPs、引物）進行4濃度梯度試驗，共16個處理，建立銀縷梅ISSR-PCR反應體系（表1）。

1.2.4銀縷梅ISSR-PCR反應單因子試驗設計。對正交試驗建立的IssR-PCR反應體系進行單因子（Taq酶、Mg²⁺、DNA、dNTPs、引物）試驗，分析不同因素對銀縷梅ISSR-PCR反應的影響（表2）。

2結果與分析

2.1目標引物確定 經(jīng)過對多態(tài)性、穩(wěn)定性以及亮度的綜合比較后，結果顯示引物845的條帶效果最好（圖1）。因此選定引物845來進行銀縷梅ISSR-PCR反應體系正交試驗探索。

2.2銀縷梅ISSR-PCR正交試驗結果 對引物845進行5因素4梯度的正交試驗（圖2），發(fā)現(xiàn)16個處理中只有處理5和9沒有擴增出條帶。對有擴增條帶的進行進一步比較，發(fā)現(xiàn)處理6條帶最清晰、多態(tài)性較好，故選取處理6進行單因子試驗。由表1可知，處理6的25μL反應體系中，DNA2.50μL（20ng/μL），Taq酶0.10μL（5U/μL），引物1.00μL（10μmoL/L），dNTPs1.50μL（2.5mmol/L），Mg²⁺3.00μL（25mmoL/L）。根據(jù)正交試驗結果，設計出單因子試驗濃度梯度（表2）。

2.3.1模板DNA濃度對銀縷梅ISSR-PCR反應的影響。最優(yōu)DNA模板濃度取決于物種基因組大小及DNA模板純度。該研究比較了25μL反應體系中模板DNA4個濃度梯度2.00、2.50、3.00、3.50txL（20ng/μL）的擴增效果，發(fā)現(xiàn)在一般情況下，隨著濃度的增加，條帶亮度和多態(tài)性都會增強。因此銀縷梅IssR—PCR體系模板DNA濃度在0.50～5.00μL（20ng/μL）時，2.50μL（20ng/μL）的效果最優(yōu)。

2.3銀縷梅ISSR-PCR單因子試驗結果 圖3為不同濃度的DNA、引物、dNTPs、Mg²⁺和Taq酶對銀縷梅ISSR-PcR反應的影響。

2.3.2引物濃度對銀縷梅ISSR-PCR反應的影響。引物濃度直接影響PcR結果的可靠性。濃度偏高可能會引起錯配和非特異性擴增，濃度過低則可能無法檢測出所有ISSR位點。試驗設置了0.80、1.00、1.20、1.40μL（10μmoL/L）4個梯度。由圖3可知，濃度在1.00μL（10μmoL/L）時條帶最多且清晰，所以該濃度是銀縷梅ISSR—PCR體系的最適引物濃度。

2.3.3dNTPs濃度對銀縷梅ISSR-PCR反應的影響。作為ISSR-PCR反應的原料，dNTPs濃度過高，會出現(xiàn)非特異性擴增條帶；反之則影響合成效率。由圖3可知，在濃度為1.50μL（2.5mmol/L）時擴增條帶亮度和多態(tài)性最好，故銀縷梅ISSR-PCR體系dNTPs最優(yōu)濃度為1.50μL（2.5mmol/L）。

2.3.4Mg²⁺濃度對銀縷梅ISSR-PCR反應的影響。Mg²⁺濃度對PCR擴增特異性和產(chǎn)物有顯著影響。比較反應體系中2.60、3.00、3.40、3.80txL（25mmol/L）4個濃度電泳結果，當Mg²⁺濃度為3.00μL（25mmol/L）時條帶多態(tài)性較豐富，因此銀縷梅ISSR-PCR體系中最適Mg²⁺濃度應為3.00μL（25mmol/L）。

2.3.5Taq酶濃度對銀縷梅ISSR-PCR反應的影響。Taq酶用量直接影響擴增反應成功與否，使用高濃度Taq酶易產(chǎn)生非特異擴增產(chǎn)物，但如果Taq酶濃度過低，則會導致產(chǎn)物合成效率下降。由圖3可知，Taq酶濃度在0.05～0.50μL（5U/μL）時，以0.10μL（5U/μL）的效果最好。

3討論與結論

ISSR-PCR是基于PCR反應的分子標記，具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的特點，建立穩(wěn)定性好、擴增效率高的反應體系是開展后續(xù)研究的基礎。ISSR反應體系容易受到模板DNA濃度和純度、引物與dNTPs用量、Mg²⁺濃度、Taq酶濃度等因素的影響，為了保證ISSR-PCR反應結果的清晰、準確，必須對擴增條件進行優(yōu)化。該試驗先采用正交設計進行初篩選，再通過單因素進行優(yōu)化，最終篩選出銀縷梅ISSR-PCR的最佳反應體系，即25txL的反應體系中DNA模板2.50μL（20ng/μL），引物濃度1.00μL（10μmol/L），Taq酶濃度0.10μL（5U/μL），Mg²⁺濃度3.00μL（25mmoL/L），dNTPs濃度1.50μL（2.5mmol/L）。上述ISSR反應體系中，關鍵影響因子為引物濃度和Taq酶濃度。引物濃度不同，擴增片段大小會呈現(xiàn)很大差異，引物濃度越高，條帶不清晰，且彌散增多。Taq酶濃度過高易產(chǎn)生非特異擴增產(chǎn)物，但如Taq酶濃度過低，則會導致產(chǎn)物合成效率下降。筆者首次針對銀縷梅ISSR-PCR反應體系開展了研究，該研究結果為以后利用ISSR開展銀縷梅遺傳多樣性及遺傳結構進一步分析奠定了基礎。