人參蛋白質(zhì)不同提取方法及含量的比較

任雨賀　劉淑瑩　萬茜淋

摘要[目的]優(yōu)選人參蛋白質(zhì)提取的最佳方法，并比較不同生長年份對人參蛋白質(zhì)含量的影響。[方法]比較丙酮沉淀法、聚乙二醇6000沉淀法、聚乙二醇20000沉淀法、酚提取法、Trizol提取法5種人參蛋白質(zhì)的提取方法，及不同生長年份的人參蛋白質(zhì)，采用Bradford方法測定蛋白質(zhì)含量，SDS-PAGE電泳鑒定蛋白。[結(jié)果]丙酮提取法得到的蛋白質(zhì)純度最高，電泳條帶最清晰完整，且人參蛋白質(zhì)的含量隨生長年份增加而升高。[結(jié)論]丙酮沉淀法是一種較好的適用于人參蛋白質(zhì)提取的方法，5年生人參蛋白質(zhì)含量最高。

關(guān)鍵詞 人參蛋白；提取方法；SDS-PAGE電泳

中圖分類號 S-3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）11-0001-03

人參（Panax ginseng C.A.Mey）為五加科草本植物人參的干燥根和根莖，為我國的名貴中藥材，被譽為“百草之王”，具有大補元氣、復脈固脫、補脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，人參具有增強記憶力、抗衰老、抗腫瘤、增強免疫力、改善心血管等作用。人參中成分復雜，主要含有人參皂苷、多糖、氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、有機酸、生物堿、黃酮、甾醇及木質(zhì)素等化學成分，目前研究主要集中在人參皂苷上，其他成分的研究相對較少，尤其是其中的蛋白質(zhì)成分。研究表明，人參蛋白質(zhì)具有保護神經(jīng)細胞、抗腫瘤、抗病毒等藥理作用。

目前，提取人參蛋白質(zhì)的方法主要有硫酸銨沉淀法、有機試劑沉淀法、膜過濾法、快速溶劑萃取法等，其中膜過濾法和快速溶劑萃取法需要特殊儀器，成本較高，而硫酸銨沉淀法操作過于繁瑣。筆者以蛋白質(zhì)提取率、純度、電泳結(jié)果為考察指標，比較有機試劑沉淀法中的丙酮沉淀法、聚乙二醇6000沉淀法、聚乙二醇20000沉淀法，及借鑒其他植物根部蛋白質(zhì)提取的酚提取法、Trizol提取法，以期對今后人參蛋白質(zhì)的研究提供借鑒。

1材料與方法

1.1材料與試劑 人參：吉林省撫松縣3、4、5年生生曬參。試劑：牛血清白蛋白（BSA）購于TIANGEN公司；考馬斯亮藍G250購于TIANGEN公司；低分子量標準蛋白Marker購于Solarbio公司；其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備 超細小型中藥粉碎機，永康市紅太陽機電有限公司；磁力加熱攪拌器，天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠；臺式高速大容量離心機，eppendorf公司；FDU-1100真空冷凍干燥機，EYELA公司；酶標儀，TECAN公司；EP600電泳儀，上海天能公司；水浴恒溫振蕩器，上海百典儀器設(shè)備有限公司。

1.3不同蛋白質(zhì)提取方法的比較

1.3.1有機試劑沉淀法。

1.3.1.1人參蛋白質(zhì)粗提液的制備。取3年生生曬參若干，粉碎機粉碎，稱取約6.0g粗粉，加入10倍量的10mmol/LTris-HCl（pH7.4）緩沖液攪拌均勻，在4℃下攪拌浸提18h。于4℃條件下，5000r/min離心30min，取上清液，于4℃保存。向沉淀中加入10倍量的10mmol/LTris-HCl（pH7.4），繼續(xù)攪拌浸提18h。于上述相同條件離心，取上清液，與第一次上清液合并，混勻，平均分成3份。

1.3.1.2丙酮沉淀法。向其中1份人參蛋白質(zhì)粗提液中加入1.5倍體積的丙酮，-20℃下靜置過夜。于4℃條件下，5000r/min離心30min，棄去上清液，下層沉淀在-20℃下放置20min揮干丙酮，轉(zhuǎn)移至-80℃過夜。凍干，蛋白干粉于-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3聚乙二醇6000沉淀法。向其中1份人參蛋白質(zhì)粗提液中加入聚乙二醇6000，使其終濃度為20%，-20℃下靜置過夜。于4℃條件下，5000r/min離心30min，棄去上清液，下層沉淀轉(zhuǎn)移至-80℃過夜。凍干，蛋白干粉于-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.4聚乙二醇20000沉淀法。向其中1份人參蛋白質(zhì)粗提液中加入聚乙二醇20000，使其終濃度為20%，-20℃下靜置過夜。于4℃條件下，5000r/min離心30min，棄去上清液，下層沉淀轉(zhuǎn)移至-80℃過夜。凍干，蛋白干粉于-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2酚提取法。參照郭廣芳等的小麥根蛋白提取方法，并略有改動。取3年生生曬參若干，粉碎機粉碎，稱取約2.0g粗粉，液氮研磨充分后加入20mL提取液（蔗糖250.6mmoL/L，Tris—HCl20mmoL/L，EDTA10mmol/L，PMSF1mmoL/L，DTrlmmoL/L和TritonX-100400mmoL/L）研磨15min。于4℃條件下，12000r/min離心15min，取上清液，加入三氯乙酸（TCA）使其終濃度為10%，一20℃沉淀過夜。以上述條件離心，棄上清，沉淀用預冷的丙酮（含0.2%DTT）洗4次，轉(zhuǎn)移至-80℃過夜。凍干，蛋白干粉于-80℃儲存。

1.3.3Trizol提取法。參照Kirkland等的蛋白質(zhì)提取方法，并略有改動。取3年生生曬參若干，粉碎機粉碎，稱取約2.0g粗粉，液氮研磨充分后加入20mLTrizol溶液，充分混勻后，加入2mL氯仿，劇烈振蕩15min，室內(nèi)靜置5min。于4℃條件下，12000r/min離心15min，棄上層水相，加入3mL95%乙醇，振蕩混勻，離心取上清。上清液中加入4倍體積的異丙醇沉淀2～3h，離心，沉淀用20mL含0.3mol/L鹽酸胍的95%乙醇溶液洗3次。室溫放置20min，然后用95%乙醇洗2次。于4℃條件下，7000r/min離心10min，沉淀轉(zhuǎn)移至-80℃過夜。凍干，蛋白干粉于-80℃儲存。

1.4不同年份人參蛋白質(zhì)含量的比較

1.4.1蛋白質(zhì)粗提液的制備。采用“1.3.1.1”方法分別提取3、4、5年生生曬參蛋白質(zhì)粗提液。

1.4.2不同年份人參蛋白質(zhì)的提取。采用“1.3.1.2”丙酮沉淀法，分別提取3、4、5年生生曬參的蛋白質(zhì)。

1.5蛋白質(zhì)定量

1.5.1標準曲線的繪制。將0、2、4、6、8、10、12、14μL牛血清白蛋白（BSA）標準溶液（1mg/mL）分別加入到96孔板中，加入PBS溶液補足至20μL，分別向各孔中加入180μL考馬斯亮藍G250染液，混勻。用酶標儀在595nm處測定吸光度（A），以不含BSA的樣品吸光度為空白對照，以蛋白濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線。

1.5.2人參蛋白質(zhì)含量測定。取不同提取方法的人參蛋白干粉分別配制成10mg/mL溶液，取2μL此溶液于96孔板中，加入18μLPBS溶液、180μL考馬斯亮藍G250染液，混勻，用酶標儀在595nm波長處測定吸光度（A），每個樣品做3次平行，測定人參蛋白質(zhì)含量，計算提取率及純度。

提取率=總蛋白質(zhì)量/人參粗粉質(zhì)量×100%

純度=總蛋白質(zhì)量/蛋白粗粉質(zhì)量×100%

1.6SDS-PAGE電泳

1.6.1蛋白樣品制備。分別稱取不同提取方法提取的蛋白干粉約10.0mg，加入1mLPBS緩沖溶液使之溶解。取40μL樣品溶解液，加10μL5×蛋白上樣緩沖液，沸水中煮5min，置于冰上備用。

1.6.2凝膠灌制及電泳過程。按所需試劑比例，分別配制15%分離膠溶液和5%濃縮膠溶液。加入TEMED后，立即快速混勻，并迅速在兩玻璃板的間隙中灌注分離膠溶液，留出灌注濃縮膠所需空間，用少量異丙醇封層。待分離膠聚合完全后（約30min），傾出封層液體，并用濾紙條擦干。在已聚合的分離膠上層灌注加入TEMED后的濃縮膠，立即在濃縮膠中插入干凈的Teflon梳子，避免進入氣泡。當濃縮膠聚合完全后（約30min），小心移出Teflon梳子，將凝膠固定于電泳裝置上，內(nèi)外槽各加入電泳緩沖液，按預定順序上樣，每個樣品20μL。接上電源，調(diào)節(jié)電壓，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120V，待樣品遷移至凝膠邊緣處即可停止。

1.6.3凝膠染色及脫色。在甲醇：水：乙酸=50：40：10的混合溶液中溶解0.25g考馬斯亮藍R250，過濾去除沉淀，用染色液浸泡凝膠，置于水浴恒溫振蕩器上平緩振蕩30min。將凝膠浸泡于不加染料的脫色液中，于水浴恒溫振蕩器上振蕩，每2h更換一次脫色液，更換3～4次，直至背景清晰。

2結(jié)果與分析

2.1不同提取方法對人參蛋白質(zhì)含量的影響

2.1.1標準曲線。蛋白定量標準曲線見圖1。曲線方程y=0.0702x+0.0238，R²=0.9957，說明此曲線方程可用于計算蛋白質(zhì)含量。

2.1.2不同提取方法對人參蛋白質(zhì)提取率及純度的影響。由圖2可知，聚乙二醇20000沉淀法提取得到的人參蛋白質(zhì)提取率最高，為8.53%；而丙酮沉淀法提取得到的人參蛋白質(zhì)純度最高，為61.05%。結(jié)合凍干后蛋白干粉的狀態(tài)，初步認為聚乙二醇20000沉淀法提取的人參蛋白質(zhì)中殘留有機溶劑較多，且不易去除，導致所提取蛋白質(zhì)純度較低。而酚提取法及Trizol提取法得到的人參蛋白干粉復溶性極差，基本不溶，因此提取率及純度均極低。丙酮提取法得到的蛋白質(zhì)也存在復溶性不好的問題，認為可能與丙酮揮干有關(guān)，可考慮延長揮干時間，以得到最佳的人參蛋白質(zhì)提取方法。

2.1.3不同提取方法對人參蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳的影響。由圖3可知，人參蛋白質(zhì)分子量主要分布在15～70kD，主要包括分子量約為64、29、27、21、18、15kD的蛋白質(zhì)，其中分子量27、29kD為主要蛋白質(zhì)。丙酮沉淀法提取的人參蛋白質(zhì)條帶最完整清晰，聚乙二醇20000沉淀法蛋白質(zhì)電泳條帶上方出現(xiàn)大量空白，推測是其中殘留有機試劑較多，且與電泳凝膠發(fā)生反應(yīng)。酚提取和Trlzol提取法提取的人參蛋白質(zhì)因其復溶性極差，電泳條帶也較淺。

2.2不同生長年份對人參蛋白質(zhì)含量的影響

2.2.1不同生長年份對人參蛋白質(zhì)提取率及純度的影響。由圖4可知，5年生生曬參人參蛋白質(zhì)的提取率最高，為3.67%，且其提取得到的人參蛋白質(zhì)純度也最高，為86.80%。這表明不同生長年份對人參蛋白質(zhì)含量有一定影響，且生長年份越長，其蛋白質(zhì)含量越高。

2.2.2不同生長年份對人參蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳的影響。由圖5可知，3、4、5年生人參蛋白質(zhì)相比，其人參蛋白質(zhì)種類并無變化，但5年生蛋白質(zhì)含量明顯升高，尤其是分子量為29、27kD的蛋白質(zhì)含量增加較多。這表明不同生長年份對人參蛋白質(zhì)含量有一定影響，且隨著年份增長蛋白質(zhì)含量逐漸升高。

3結(jié)論與討論

蛋白質(zhì)是生命活動的物質(zhì)基礎(chǔ)，是人類生命活動不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)。植物蛋白一般分為2類：一類是完全蛋白，如大豆蛋白；另一類是不完全蛋白，絕大多數(shù)的植物蛋白屬于此類。但因蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)復雜，物理和化學性質(zhì)不穩(wěn)定，因此在植物蛋白質(zhì)提取過程中要綜合考慮各種因素對其的影響。該研究對幾種不同人參蛋白質(zhì)提取方法進行了對比，其中酚提取法是參考小麥根部蛋白質(zhì)提取方法優(yōu)化，Trlzol提取法是參考嗜鹽蛋白質(zhì)的提取方法優(yōu)化，而2種提取方法得到的蛋白質(zhì)復溶性均較差，均不適用于人參蛋白質(zhì)的提取。聚乙二醇20000沉淀法得到的人參蛋白質(zhì)提取率最高，但其純度較低，推測是其中殘留有機試劑較多，并與電泳凝膠反應(yīng)，且無法確定其含量及毒性，因此不是提取人參蛋白質(zhì)的最佳方法；丙酮沉淀法雖然提取率不是最高，但其純度較高，提取過程中丙酮成分可以通過揮干的方法去除，且其電泳條帶最清晰完整。綜合考慮，人參蛋白質(zhì)的最佳提取方法為丙酮沉淀法。

該研究采用丙酮提取法分別提取了3、4、5年生人參蛋白質(zhì)，并進行了蛋白質(zhì)含量的比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3年生人參蛋白質(zhì)含量最低，4年生人參蛋白質(zhì)含量居中，而5年生人參蛋白質(zhì)含量最高，分子量27、29kD的蛋白質(zhì)含量增多最明顯。經(jīng)查閱文獻，分子量為27、29kD的人參蛋白質(zhì)屬核糖核酸酶類，具有抗真菌、抗病毒和抑制增殖的活性。

綜上所述，經(jīng)過上述5種植物蛋白質(zhì)提取方法比較得出，丙酮沉淀法是一種較好的適用于人參蛋白質(zhì)提取的方法。經(jīng)過對不同生長年份人參蛋白質(zhì)的對比，人參生長年份對其蛋白質(zhì)含量有一定影響，隨著生長年份的增加，人參蛋白質(zhì)含量逐漸升高，即3年生人參蛋白質(zhì)含量最低，5年生人參蛋白質(zhì)含量最高。