微生物肥料對(duì)草莓根腐病防治效果及對(duì)根圍土壤微生物群落多樣性的影響

李麗艷 朱瑞艷 杜迎輝 肖艷

摘要?[目的]探究微生物施肥技術(shù)對(duì)草莓根腐病的防治效果，為進(jìn)一步合理應(yīng)用微生物肥料防治草莓重茬病害提供理論依據(jù)。[方法]在草莓生長期施用微生物肥料，于膨果期調(diào)查草莓根腐病發(fā)病情況，并采集土樣提取土壤基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增建立文庫，利用Miseq 平臺(tái)Illumina 第二代高通量測(cè)序技術(shù)并結(jié)合相關(guān)生物信息學(xué)分析土壤細(xì)菌16S rRNA基因V3+V4 區(qū)域和真菌ITS1 區(qū)域的豐富度和多樣性指數(shù)以及群落結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]微生物肥料可使草莓根腐病發(fā)病率降低36.3%，平均防效達(dá)63.9%;顯著降低鐮孢菌屬的相對(duì)豐度，較對(duì)照區(qū)降低了97.56%，明顯提高了有益細(xì)菌芽孢菌屬的相對(duì)豐度，較對(duì)照區(qū)提高了30.37%。[結(jié)論]微生物肥料可有效改善土壤微生物區(qū)系并提高作物產(chǎn)量、改善草莓品質(zhì)。

關(guān)鍵詞?草莓根腐病;微生物肥料;微生物群落多樣性

中圖分類號(hào)?S144文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2018）33-0111-03

近年來，由于草莓市場(chǎng)需求逐年擴(kuò)大，種植草莓的連作重茬地面積逐年增加，從而造成草莓根部病害逐年加重，其中草莓根部重要病害之一是草莓根腐?。╯trawberry root rot）。草莓根腐病是一種較典型的根部土壤傳播病害，防治困難，特別是種植在連作多年草莓地塊的草莓更容易發(fā)生草莓根腐病。輕則造成草莓產(chǎn)量下降，重則造成草莓絕收[1]。隨著我國棚區(qū)草莓種植面積的逐年增加，草莓根腐病的發(fā)生也呈逐年上升趨勢(shì)，已成為制約草莓產(chǎn)業(yè)正常發(fā)展的主要因素之一[2-3]。

在防治該病方面，農(nóng)藥等化學(xué)藥劑的作用巨大，也顯而易見，但長期頻繁使用化學(xué)藥劑也在很大程度上增強(qiáng)了病原菌的抗藥性，從而使得化學(xué)藥劑的防治效果越來越差[2]，且長期、大量、頻繁地使用農(nóng)藥等化學(xué)藥劑容易破壞整體生態(tài)平衡，引起各種環(huán)境污染，危害人類健康[1-2]。探尋一條新的途徑來克服或緩解這些制約草莓生產(chǎn)的影響因素具有重要意義。

為此，筆者以常規(guī)施肥為對(duì)照，選取有代表性的草莓根腐病發(fā)病地塊，研究“富思德”微生物肥料對(duì)草莓根腐病的防治效果以及對(duì)草莓根圍土壤微生物群落多樣性的影響，旨在為采用微生物肥料調(diào)節(jié)草莓的連作障礙防控技術(shù)提供參考。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

“富思德”熒光假單胞菌劑（領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司）：有效活菌數(shù)≥5億/mL;“富思德”生物有機(jī)肥（領(lǐng)先生物農(nóng)業(yè)股份有限公司）：有效活菌數(shù)≥0.2億/g，有機(jī)質(zhì)≥40.0%。作物為連續(xù)種植6年棚的草莓，品種為紅顏99。

1.2?試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2015年9月在秦皇島昌黎左豐臺(tái)草莓種植區(qū)進(jìn)行。對(duì)照區(qū)為常規(guī)化學(xué)肥料，肥料用量（折合成純養(yǎng)分）為N 330 kg/hm2 、P2O5 240 kg/hm2、K2O 560 kg/hm2。采用大區(qū)對(duì)比試驗(yàn)，各處理面積為667 m2，不設(shè)重復(fù)。試驗(yàn)設(shè)2個(gè)處理：以常規(guī)施肥作為對(duì)照區(qū)（CMB01）;微生物肥料（CMJ02）為處理區(qū)。定植前基施“富思德”生物有機(jī)肥2 250 kg/hm2;分別在草莓定植期、緩苗期、開花期、膨果期、第一次摘果期、第二次摘果期沖施“富思德”熒光假單胞菌劑75 L/hm2。草莓對(duì)照區(qū)及處理區(qū)各時(shí)期施肥及管理措施均為當(dāng)?shù)胤N植人員常規(guī)管理模式。

1.3?試驗(yàn)方法

1.3.1?發(fā)病率調(diào)查。

在草莓膨果期調(diào)查草莓根腐病發(fā)病情況，每個(gè)處理隨機(jī)選取6行，每行10 m。發(fā)病率、病情指數(shù)和防效分別按照下列公式計(jì)算[4-7]。

發(fā)病率=死苗棵數(shù)/調(diào)查區(qū)間種植總棵數(shù)×100%

病情指數(shù)=[（病級(jí)株數(shù)×代表值）/（總株數(shù)×最高病級(jí)代表值）]×100

防效=（對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/對(duì)照區(qū)病情指數(shù)×100%

草莓根腐病發(fā)病程度參考[8-9]的方法分為6 級(jí)。0 級(jí)為根系未見發(fā)病;1 級(jí)為根系發(fā)病率≤30%，葉片較為正常;2 級(jí)為30%<根系發(fā)病率≤60%，葉片較為正常;3 級(jí)為60%<根系發(fā)病率≤80%，葉片已開始變黃;4 級(jí)為根系發(fā)病率80%以上，葉片已枯萎;5 級(jí)為整株死亡，葉片整體干枯。

1.3.2?根際土壤微生物多樣性分析

1.3.2.1?土壤微生物DNA提取。

分別在盛果期取對(duì)照區(qū)及處理區(qū)草莓根際土樣，采集時(shí)間為2016年4月，每個(gè)處理隨機(jī)選取5個(gè)取樣點(diǎn)，用螺旋取土鉆采集0～10 cm表層新鮮土壤，除去雜物、根系，研磨并過2 mm篩后混合[10]。針對(duì)每種新鮮土壤，分別稱取0.5 g，3個(gè)重復(fù)。用FastDNA Spin Kit for Soil 試劑盒（ MP Biomedicals）提取土壤微生物基因組總DNA[10]，將提取得到的土壤DNA溶解于50 μL TE 緩沖液，詳細(xì)操作步驟參考試劑盒說明書。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，DNA 樣品于-20 ℃冰箱保存待用。

1.3.2.2?試驗(yàn)流程。

提取土壤樣品總DNA后，根據(jù)文獻(xiàn)[11]得到細(xì)菌V3+V4（F：5′-ARACTYCTACGGRAGGCWG-3′;R：5′-GACTACNVGGGTATCTAATCC-3′）和真菌ITS1（F：5′-AACCTGCGGAAGGATCATT-3′;R：5′-GARCCAAGAGATCCRTTG-3′）合成引物，PCR擴(kuò)增并進(jìn)行純化、定量和均一化后建立測(cè)序文庫，質(zhì)檢合格的文庫用Illumina HiSeq PE250進(jìn)行測(cè)序[12]，該測(cè)序工作由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。

1.3.3?產(chǎn)量及品質(zhì)調(diào)查。