2016—2017年我國部分地區(qū)白斑綜合征病毒wsv006的變異分析

蔡苗 劉慶慧 萬曉媛 黃倢

摘要?[目的]了解wsv006蛋白結(jié)構(gòu)變異情況，并進一步為其蛋白功能研究提供參考資料。[方法]以2016和2017年在全國18個地區(qū)采集的WSSV陽性樣品為模板，采用PCR方法，用特異性引物擴增wsv006基因，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化后進行測序，并對測序結(jié)果進行分析。[結(jié)果]在2016年的47 份樣本中有9個樣本，包括河北黃驊、山東日照、河北滄州和河北唐山4個地區(qū)的樣本中出現(xiàn)了wsv006目的條帶，檢出率為19%。在2017年的39 份 WSSV 陽性樣本中有16個樣本，包括福建霞美鎮(zhèn)、河北黃驊、廣東湛江、山東濱州、山東東營和上海6個地區(qū)的樣本中出現(xiàn)了wsv006的目的條帶，檢出率為41%。氨基酸序列比對結(jié)果顯示，擴增的wsv006編碼氨基酸變異包括氨基酸替換、插入、缺失和提前終止翻譯，其中插入的主要是脯氨酸（P）和蘇氨酸（T），插入位點在第151～166位，處于PT的交叉重復區(qū)域;終止翻譯是由于核苷酸第541位插入了GAGG，在轉(zhuǎn)錄過程中形成了終止密碼子。[結(jié)論]wsv006氨基酸序列存在明顯變異。

關鍵詞?WSSV;wsv006;變異

中圖分類號?S945.4文獻標識碼 A文章編號?0517-6611（2018）33-0075-05

對蝦白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）是一類無包涵體的具囊膜、 一端有尾巴狀結(jié)構(gòu)、桿狀的雙鏈環(huán)狀 DNA病毒[1]，大小約為300 kb。1992年，WSSV最早在我國臺灣等地的對蝦養(yǎng)殖區(qū)暴發(fā)，而后在亞洲各國對蝦養(yǎng)殖區(qū)相繼暴發(fā)，給全世界各地的對蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[2]，從而引起全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)者的廣泛關注。1995年，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）及亞太水產(chǎn)業(yè)養(yǎng)殖中心（NACA）將WSSV列為需要通告的重要水生動物疾病病原[3]。2001年，中國和荷蘭科學家分別報道了該病毒的全基因組DNA序列，啟動了WSSV后基因組研究[4]。2005年，國際病毒分類委員會第7次報告提出把WSSV歸入到線形病毒科（Nimaviridae）白斑病毒屬（Whispovirus），它是此新科中唯一的成員[5]。2009年，該病毒被農(nóng)業(yè)部《一、二、三類動物疫病病種名錄》列為水生生物一類動物疫病病毒[6]。WSSV感染的宿主范圍很廣，它不僅侵染各種野生及養(yǎng)殖對蝦，而且侵染其他水生甲殼類，如蟹類、螯蝦和龍蝦等，已成為對水生甲殼類危害最大、傳染最廣泛的病毒，特別是對對蝦種群影響最嚴重，至今已報道有40多種節(jié)肢動物可感染或攜帶WSSV[6-8]。

迄今為止，GenBank上共公布了7個WSSV基因全序列，研究最多的分別有中國大陸株（WSV-CN）[9]、中國臺灣株（WSSV-TW）[10]和泰國株（WSSV-TH）[11]。MARKS等[12]通過基因組全序列比對歸納出這3個毒株的基因組之間序列有約99%的核苷酸保持一致性，存在的主要差異是：①大片段序列插入/缺失;②易于發(fā)生基因重組的變異區(qū);③開放性閱讀框（open reading frames，ORFs）內(nèi)出現(xiàn)的重復單元變化差異（variable ?number ?tandem ?repeat，VNTR）[9，11];④轉(zhuǎn)座酶基因序列存在與否;⑤單核苷酸的缺失、插入及多態(tài)性（singlenucleotide polymorphisms，SNPs）。目前應用于WSSV流行病學研究的主要有ORF14/15和ORF23/24的缺失變化，ORF75、ORF94和ORF125的VNTR 數(shù)目以及單核苷酸多態(tài)性[13]，而對于WSSV其他基因的變異情況及其在WSSV流行病學研究中的作用尚未有深入的研究。wsv006基因全長885 bp，編碼295個氨基酸，有關其在不同地理樣本中的變異情況尚不清楚。該研究通過對2016和2017年我國18個地區(qū)WSSV病害暴發(fā)區(qū)采集的86份WSSV陽性樣本進行wsv006基因的 PCR 擴增、克隆和測序，分析wsv006蛋白結(jié)構(gòu)變異，為WSSV分子流行病學研究提供參考資料。

1?材料與方法

1.1?樣本來源?取2016和2017年1—7月在全國18個地區(qū)WSSV病害暴發(fā)區(qū)采集的患病樣本，樣本采集信息及各個樣本對應的wsv006擴增結(jié)果見表1、2。所有樣品采集后當天冷藏運輸至實驗室后冷凍保存在-20 ℃冰箱。

1.2?主要試劑和引物

海洋動物組織基因組 DNA 提取試劑盒（離心柱型） 購自擎科生物技術(shù)（青島）有限公司;Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs和DNA Marker均購自寶生物工程（大連） 有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自索萊寶生物科技（北京）有限公司;pMD18-T克隆載體、感受態(tài)細胞TOP10均購自青島秀佰銳生物器材有限公司;LB培養(yǎng)基、氨芐青霉素購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司。

1.3?病毒核酸提取?取約30 mg鰓組織，進行DNA提取，提取產(chǎn)物置于-20 ℃冰箱備用。

1.4?樣本的套式PCR檢測?將DNA樣本按照《白斑綜合征（WSD）診斷規(guī)程GB/T 28630.2—2012》第2部分套式PCR 檢測法進行WSSV檢測，而后通過1%瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.5?wsv006基因的PCR擴增

將“1.3”中檢測呈WSSV 陽性的樣本進行 wsv006基因擴增。采用25 μL的體系：10× PCR 反應緩沖液（含 Mg2+） 2.5 μL、雙蒸水17.3 μL、dNTP 2 μL、正向引物（5-ATGAAGAATTCGCGGCAGAG-3）與反向引物（5- GGAAGATCTGAAGGAACTG-3）各1 μL，Ex Taq DNA 聚合酶 0.2 μL，WSSV 模板1 μL。PCR擴增程序為94 ℃預變性5 min;94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃30 s，擴增35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。

46卷33期?蔡 苗等?2016—2017年我國部分地區(qū)白斑綜合征病毒wsv006的變異分析

1.6?wsv006基因的克隆及序列分析

將“1.5”中的陽性 PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與載體 pMD18-T 連接，轉(zhuǎn)化至TOP10感受態(tài)細胞中，在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h復蘇抗性，然后在添加氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上涂布，37 ℃過夜培養(yǎng)，每個平板挑取至少5個單菌落接種于添加氨芐青霉素的 LB液體培養(yǎng)基中 37 ℃ 振蕩4 h，取培養(yǎng)物為模板，按“1.5”方法進行鑒定，將PCR鑒定為陽性的菌液全部送到上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行DNA雙向測序。測序結(jié)果采用DNAMAN8軟件進行序列比對分析，用ORF Finder處理測序結(jié)果，得到編碼的氨基酸序列，然后再用DNAMAN8軟件分析，以中國株wsv006氨基酸序列作為參照（AF332093），得出氨基酸水平上的變異情況。

2?結(jié)果與分析

2.1?套式 PCR 檢測結(jié)果

2016年的47份樣本中，共有33份樣本在第1輪擴增中呈現(xiàn)WSSV陽性，其余14份樣本均在第2輪擴增中呈現(xiàn)陽性。而2017年的39份樣本中共有9份樣本在第1輪擴增中呈現(xiàn)WSSV陽性，其余30份樣本均在第2輪擴增中呈現(xiàn)陽性。

2.2?wsv006基因的克隆

2016年的47份樣本中，PCR 擴增只在河北黃驊、山東日照、河北滄州和河北唐山4個地區(qū)的樣本中出現(xiàn)了wsv006目的條帶，共有9個樣本，檢出率為19%，分別是HH-6、SR-13、SR-15、HC-19、HT-34、HT-35、HT-36、HT-40、HT-41;其余38個樣本均未擴增出該基因片段。 在2017年的44 份WSSV陽性樣本中，PCR擴增只在福建霞美鎮(zhèn)、河北黃驊、廣東湛江、山東濱州、山東東營和上海6個地區(qū)的樣本中出現(xiàn)了wsv006目的條帶，共有16個樣本，檢出率為41%，分別是FX-7、FX-8、FX-9、FX-10、FX-11、FX-13、FX-14、HH-15、HH-16、HH-17、GZ-28、GZ-29、GZ-30、ZT-36、SB-37、SH-39，其余23個樣本均未擴增出該基因片段。

2.3?序列比對?在擴增出wsv006的25個樣本中，除2017年河北黃驊的3個樣本氨基酸未發(fā)生變異外，其余22個樣本的wsv006編碼氨基酸變異明顯。氨基酸的變異類型為單個氨基酸替換與缺失、多個氨基酸插入和終止翻譯（表3、4）。在不同年份和地區(qū)的樣本中插入位點、插入序列數(shù)目和排列順序存在差異，插入的主要是脯氨酸（P）和蘇氨酸（T），插入位點處于這2種氨基酸的交叉重復區(qū)域，該區(qū)域存在2個PTPTPTPP重復單元，經(jīng)過DNAMAN比對結(jié)果顯示插入位點有3個，即第1個單元之前、2個單元之間和第2個單元之后，由于插入序列為PT循環(huán)或PT循環(huán)與PP交叉，這與重復單元序列極為相似，因此不能確定具體的插入位點，僅能確定在第151～166位。除去提前終止和未變異的樣本，由于插入氨基酸導致wsv006肽鏈的長度由原來295 aa分別變?yōu)?01、303、305和307 aa，其中301 aa長度出現(xiàn)在2016年河北唐山和2017年山東濱州的樣本中，插入序列為PTPTPT（圖1）;303 aa長度出現(xiàn)在2016年河北黃驊和2017年廣東湛江的3個樣本中，插入序列為PTPTPTPT（圖2）;305 aa長度在2016年河北唐山和2017年福建霞美鎮(zhèn)、上海的樣本中出現(xiàn)，共7個樣本，插入序列為PTPTPTPTPT;福建霞美鎮(zhèn)的FX-8樣本長度為307 aa，插入序列為PTPTPTPTPTPT（圖3）。2016年山東日照和河北滄州、唐山的樣本以及2017年山東東營的樣本中都出現(xiàn)了在第184位提前終止翻譯的現(xiàn)象（圖4），這主要是由于核苷酸序列的第541位插入了GAGG，導致了移碼突變，在轉(zhuǎn)錄過程中第543～545位形成了終止密碼子UGA。除去終止翻譯的樣本，其余的16個樣本均在第172位出現(xiàn)氨基酸的替換，T→I。

3?討論

2016年的樣本中，同一地區(qū)的樣本變異情況存在差異性，如河北黃驊的樣本中，其wsv006基因編碼長度包含301、305 aa，并出現(xiàn)提前終止翻譯的現(xiàn)象。不同地區(qū)的變異情況也存在相似性，河北黃驊的HH-06和河北唐山的HT34、HT35和HT40變異情況相似，其中HT34和HT40的序列完全相同。山東日照的SR-13和SR-15，河北滄州的HC-19和河北唐山的HT-36和HT-41出現(xiàn)的變異類型一致，并且都在第184位終止翻譯，其中SR-13、HC-19、HT-36和HT-41序列完全相同。2017年的樣本中，同一地區(qū)樣本變異情況的一致性主要體現(xiàn)在河北黃驊和廣東湛江的樣本中;而福建霞美鎮(zhèn)的樣本除FX-07以外，其他6個樣本序列完全相同，在表現(xiàn)出差異性的同時又保持了一致性。山東東營SD-38出現(xiàn)3種變異類型，即替換、插入和缺失，并且它還是2017年樣本中唯一出現(xiàn)提前終止的樣本。

將這些樣本經(jīng)過motify scan軟件分析后發(fā)現(xiàn)，這些變異位點并不在其功能域內(nèi)。插入序列主要是脯氨酸（P）和蘇氨酸（T），脯氨酸能夠增強植物的抗性，有研究表明，植株染病毒的番茄花藥發(fā)育過程中游離脯氨酸積累開始較晚，任一花藥發(fā)育時期花藥中的游離脯氨酸含量均低于同一發(fā)育時期的健康植株，花粉萌發(fā)率也低[14]。植物在環(huán)境脅迫條件下，脯氨酸對植物的生理代謝有很大影響[15]。蘇氨酸的結(jié)構(gòu)中含有羥基，對人體皮膚具有持水作用，與寡糖鏈結(jié)合，對保護細胞膜起重要作用，在體內(nèi)能促進磷脂合成和脂肪酸氧化。目前，德國科學家在人體血液中發(fā)現(xiàn)了一種蘇氨酸，試驗發(fā)現(xiàn)它可以阻止艾滋病病毒附著和侵入體細胞，通過干擾艾滋病病毒的表面蛋白，使其不能發(fā)揮作用。因此，wsv006功能以及氨基酸變異對其功能的影響需要深入研究。

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