霍山石斛多糖不同組分理化性質(zhì)及免疫活性的比較研究

王超群 李德文 袁晨琳 羅建平

摘要 [目的]對比研究霍山石斛多糖不同組分的理化性質(zhì)及對巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。[方法]采用DEAE陰離子交換層析和Sephadex G-100凝膠色譜層析分離多糖，通過HPGPC、GC、GC-MS和ELISA分析多糖的理化性質(zhì)和免疫活性，采用主成分分析比較多糖的免疫活性，并結(jié)合多元線性回歸分析方法，定量分析多糖的構(gòu)效關(guān)系。[結(jié)果]霍山石斛多糖包含DHPW-1、DHPW-2、DHPW-3、DHPW-4、DHPW-5、DHPW-6和DHPW-7 7種分子量和均一度各不相同的組分，它們是由葡萄糖、半乳糖和甘露糖以不同的摩爾比按1，4-D-Glcp、1，6-D-Glcp、T-D-Galp、1，4，6-D-Glcp和1，3，6-D-Manp的連接方式所組成，均能不同程度地促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌NO、TNF-α和IL-1β，增強(qiáng)吞噬中性紅的能力。[結(jié)論]霍山石斛多糖不同組分的理化性質(zhì)和刺激巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性各不相同，不同連接方式的糖苷鍵含量和多糖的分子量對它們的免疫活性具有重要影響， 其中DHPW-2與DHPW-4免疫調(diào)節(jié)活性較好，DHPW-7 的活性最差。

關(guān)鍵詞 霍山石斛；多糖；巨噬細(xì)胞；免疫調(diào)節(jié)活性

中圖分類號 S567.23+9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）13-0160-05

Comparative Study on Physicochemical Properties and Immunomodulating Activities of Different Components of Dendrobium huoshanense Polysaccharide

WANG Chaoqun1，LI Dewen2，YUAN Chenlin1 et al

（1.School of Food Science and Engineering，Hefei University of Technology，Hefei ，Anhui 230009；2.Anhui Kang Erxin Biological Pharmaceutical Co.，Ltd.，Huaibei，Anhui 235100）

Abstract [Objective]To compare the physicochemical properties of different components of Dendrobium huoshanense and the immunomodulatory effect on macrophages. [Method]The crude polysaccharides of D.huoshanense （DHP） were fractionated by DEAE anionexchange column and gel filtration of Sephadex G100 in turn.High performance gelpermeation chromatography （HPGPC），gas chromatography （GC），gas chromatographymass spectrometry （GCMS） and enzymelinked immunosorbent assay （ELISA） were used to analyze the physicochemical properties and immunomodulatory activities of polysaccharides.The immunomodulating activies of the different fractions of polysaccharides were compared by principal component analysis method，and the quantitative analysis of the structure-activity relationship of the polysaccharides was carried out by combining multiple linear regression analysis. [Result]Seven fractions of polysaccharides including DHPW1，DHPW2，DHPW3，DHPW4，DHPW5，DHPW6 and DHPW7 had different molecular weight and homogeneity.They consisted of glucose，galactose and manose with different molar ratio，glycosidic types including 1，4DGlcp，1，6DGlcp，TDGalp，1，4，6DGlcp and 1，3，6DManp.All the fractions could promote the release of NO，TNFα and IL1β from macrophages，enhance the ability to phagocytose neutral red. [Conclusion]The physicochemical properties of different fractions of DHP and the immunomodulatory activities of stimulating macrophages were different.The content of glycosidic linkages and the molecular weight of polysaccharides of different fractions had important influence on their immunocompetence.DHPW2 and DHPW4 had relatively better immunomodulatory activity while DHPW7 activity were the lowest in the seven fractions from DHP.

Key words Dendrobium huoshanense；Polysaccharide；Macrophage；Immunemodulatory activities

霍山石斛（Dendrobium huoshanense），又稱米斛，蘭科石斛屬多年生草本植物，主產(chǎn)于安徽霍山等地，是一種珍貴的中藥材，具有生津益胃、抗白內(nèi)障、抗腫瘤等功效[1]。多糖是霍山石斛的主要活性成分，近年來有關(guān)霍山石斛多糖的提取分離[2-3]、結(jié)構(gòu)鑒定[4]和生物活性研究取得了長足的進(jìn)展[5]。研究發(fā)現(xiàn)，霍山石斛多糖是由多種分子量不同的組分組成，但尚不清楚這些不同組分是否具有相同的理化特性和生物活性[6]。筆者在研究霍山石斛多糖不同組分理化性質(zhì)的基礎(chǔ)上，通過測定小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對不同組分多糖的免疫調(diào)節(jié)能力， 同時結(jié)合多元線性回歸分析法將免疫調(diào)節(jié)活性和化學(xué)結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行關(guān)聯(lián)，探討它們之間的構(gòu)效關(guān)系，以期為霍山石斛多糖的功能性食品及藥品開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗所用粗多糖鄰苯二甲酸二乙酯（DHP）是從霍山石斛類原球莖中提取獲得（霍山石斛類原球莖由合肥工業(yè)大學(xué)中草藥與功能食品研究所提供），轉(zhuǎn)接于MS固體培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度（25±2）℃、光照時間16 h/d、相對濕度80%條件下培養(yǎng)30 d作為試驗材料。SPF級雌性昆明小鼠，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號：皖醫(yī)實動準(zhǔn)9901。

1.2 霍山石斛粗多糖分離純化

將霍山石斛粗多糖DHP上樣于DEAE-Cellulose色譜柱，經(jīng)水洗收集多糖DHPW， 將DHPW經(jīng)Sephadex G-100分離，收集各洗脫峰，獲得DHPW-1、 DHPW-2、DHPW-3、DHPW-4、DHPW-5、DHPW-6和DHPW-7這7種組分多糖。

1.3 多糖的理化性質(zhì)分析

多糖的相對分子質(zhì)量及均一性采用高效凝膠滲透色譜法（HPGPC）測定，檢測器為示差折光檢測器。剛果紅試驗分析多糖的螺旋構(gòu)象。多糖的單糖組成和甲基化分析分別用氣相色譜（GC）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）進(jìn)行測定，具體操作參照文獻(xiàn)[6]的方法。

1.4 多糖的免疫活性測定

根據(jù)文獻(xiàn)的方法[7]分離純化小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為7×106個/mL，置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔加入90或180 μL細(xì)胞懸浮液和10或20 μL不同濃度多糖的RPMI 1640溶液（多糖終濃度400、200、100、50、25、10 μg/mL）；空白對照為RPMI 1640，陽性對照為脂多糖（LPS），終濃度為5 μg/mL，每組4個平行。置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，4 ℃、1 000 r/min離心10 min取上清培養(yǎng)液，采用中性紅法[8]測定巨噬細(xì)胞對中性紅的吞噬作用，用NO試劑盒按硝酸還原酶法測定NO含量，用ELISA試劑盒測定TNF-α和IL-1β含量，具體方法參照各試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作程序。采用多黏菌素B（PMB）屏蔽LPS的方法[9]，檢測PMB預(yù)處理后的多糖對腹腔巨噬細(xì)胞NO含量的影響，來分析多糖是否被LPS污染。

1.5 不同多糖組分理化性質(zhì)與免疫活性的關(guān)系分析

利用SPSS 17.0進(jìn)行主成分分析法，對各組分多糖的免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行評價，獲得DHPW各組分多糖的綜合排名，再在主成分分析的基礎(chǔ)上，設(shè)置結(jié)構(gòu)特征作為自變量Xi （i=1，2，…，p），多糖的免疫調(diào)節(jié)活性指標(biāo)作為因變量，擬合出各組分多糖免疫調(diào)節(jié)活性與結(jié)構(gòu)特征之間的多元線性回歸方程（Y=β0+β1X1+β2X2+…+βPXP+ε），對多糖的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖不同組分的理化性質(zhì)

HPGPC分析顯示，7種組分多糖的相對分子量及其多分散系數(shù)各不相同（表1）。多糖的均一性在一定程度上與其多分散性系數(shù)（d）有關(guān)。d=Mw/Mn，d值越接近1，表示均一性越好；d值越偏離1，則均一性越差。在7種組分多糖中，DHPW-3、DHPW-4、DHPW-5、DHPW-6 4個組分d值最接近1，均一性好；DHPW-2、DHPW-7均一性較差；而DHPW-1的d值最高，為雜多糖。單糖組成結(jié)果（表1）表明，7種多糖主要由葡萄糖（Glc）、甘露糖（Man）和半乳糖（Gal）這3種單糖組成，但它們的組成比例有所不同。對其他6種多糖來說，DHPW-1的Gal和Man含量較高，而Glc含量較低。DHPW-2、DHPW-3、DHPW-4、DHPW-5、DHPW-6、DHPW-7這6種多糖的Glc含量均高于90%，Man和Gal含量均低于6%，且多糖中Glc含量有逐漸升高的趨勢，Man和Gal含量有逐漸降低的趨勢，DHPW-7中Glc含量最高，達(dá)97.27%，而Man含量最低，僅有1.14%。

當(dāng)多糖能夠與剛果紅結(jié)合形成絡(luò)合物，證明它具有螺旋構(gòu)象，主要表現(xiàn)為與剛果紅相比，絡(luò)合物的最大吸收峰移向長波。從圖1可以看出，DHPW-2、DHPW-3、DHPW-4、DHPW-5、DHPW-6和DHPW-7與剛果紅相比均無明顯的波長遷移，表明不具有螺旋結(jié)構(gòu)，而DHPW-1在NaOH濃度較小時，與剛果紅相比紫外吸收有明顯的向長波遷移現(xiàn)象，說明DHPW-1能夠與剛果紅形成絡(luò)合物，認(rèn)為DHPW-1具有螺旋構(gòu)象。隨著NaOH濃度升高，DHPW-1最大吸收波長明顯下降，推測是高濃度的NaOH導(dǎo)致DHPW-1分子間的氫鍵被破壞，螺旋構(gòu)象解體，無法與剛果紅形成絡(luò)合物。

甲基化分析（表2）顯示，7種組分多糖的甲基化產(chǎn)物主要為2，3，6-Me3-Glcp、2，3，4-Me3-Glcp，并含有少量的2，3，4，6-Me4-Galp、2，3-Me2-Glcp、2，4-Me2-Manp，它們分別對應(yīng)1，4-D-Glcp、1，6-D-Glcp、T-D-Galp、1，4，6-D-Glcp、1，3，6-D-Manp糖殘基。5種糖殘基中，1，4-D-Glcp和1，6-D-Glcp含量最高，T-D-Galp其次，含量最低的為1，3，6-D-Manp，該結(jié)果與單糖組成GC分析結(jié)果相一致。雖然各組分的糖苷鍵種類相似，但組成的比例差異明顯。其中，DHPW-1的各殘基摩爾比與其他6種多糖相比差別最大，其T-D-Galp和1，3，6-D-Manp在7種多糖中含量最高。其他6種多糖中1，4-D-Glcp、1，6-D-Glcp和1，4，6-D-Glcp比例逐漸升高，T-D-Galp和1，3，6-D-Manp比例逐漸降低。DHPW-7中1，4-D-Glcp、1，6-D-Glcp和1，4，6-D-Glcp在7種多糖中含量最高，1-D-Galp和1，3，6-D-Manp含量最低。

2.2 多糖不同組分的免疫活性

植物多糖作用于巨噬細(xì)胞可促進(jìn)細(xì)胞系增殖；誘導(dǎo)NO、活性氧簇（ROS）的產(chǎn)生，增強(qiáng)iNOS的活性及表達(dá)；促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌和相關(guān)基因的表達(dá)，提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能[13-16]。由圖2可知，7種多糖PMB預(yù)處理組與PMB未處理組相比NO濃度無顯著差別，同時培養(yǎng)基中的內(nèi)毒素含量為0.108 7 EU/mL，含量極低，認(rèn)為7種多糖和培養(yǎng)基均未被LPS污染，對免疫測定結(jié)果無影響。圖3結(jié)果表明，7種多糖在10～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO的表現(xiàn)有所不同，其中DHPW-5對巨噬細(xì)胞合成NO的作用呈低劑量促進(jìn)、高劑量抑制的劑量關(guān)系，最佳作用的質(zhì)量濃度是50 μg/mL，而其余6種多糖對巨噬細(xì)胞合成NO的促進(jìn)作用隨著質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，均在200 μg/mL質(zhì)量濃度條件下表現(xiàn)出最佳的促進(jìn)作用。與空白對照組相比，DHPW-1～DHPW-7 這7種多糖在各自最有效質(zhì)量濃度時，巨噬細(xì)胞合成NO的能力分別提高了147、1.54、1.28、1.29、1.41、1.36和1.44倍。

TNF-α主要由激活的巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生，是抗腫瘤免疫反應(yīng)中的一種重要的細(xì)胞因子，也是一種重要的巨噬細(xì)胞活性指標(biāo)[17]。圖4顯示，7種組分多糖在不同程度上均可促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌TNF-α。在10～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，DHPW-1、DHPW-3、DHPW-4、DHPW-5以及DHPW-7這5種組分多糖作用巨噬細(xì)胞促進(jìn)TNF-α分泌的最佳濃度為200 μg/mL，分泌量會隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而增加，而DHPW-2和DHPW-6最佳作用濃度為100 μg/mL。與空白對照組相比，DHPW-1～DHPW-7這7種多糖在各自最有效質(zhì)量濃度時，巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的能力分別提高了2.11、2.06、1.87、2.00、1.65、1.62和1.43倍。

IL-1β也是由激活的巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生，在抗腫瘤免疫反應(yīng)中起重要作用的一種細(xì)胞因子[18]。由圖5可知，當(dāng)多糖濃度低于25 μg/mL時，7種多糖均不能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β，隨著濃度的升高，DHPW-4表現(xiàn)出較為明顯的分泌IL-1β的能力；當(dāng)多糖濃度達(dá)到50 μg/mL時，DHPW-5組的IL-1β濃度與空白組相比也顯著升高，但除DHPW-4和DHPW-5外的其他多糖均不能有效地分泌IL-1β；當(dāng)多糖濃度達(dá)到100 μg/mL時，DHPW-1和DHPW-6顯示出較強(qiáng)分泌IL-1β的能力，其中DHPW-1組IL-1β濃度相對較低，DHPW-4組IL-1β濃度最高；當(dāng)多糖濃度達(dá)到200 μg/mL時，除DHPW-2和DHPW-3外，其他5種多糖均能夠有效地增強(qiáng)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β的能力，其中仍以DHPW-4的效果最為明顯。上述分析表明，在能夠有效促進(jìn)巨噬細(xì)胞

分泌IL-1β的DHPW 5種組分多糖中，DHPW-1、DHPW-4、

DHPW-6、DHPW-7 4種多糖促進(jìn)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-1β時均顯示出較為明顯的劑量依賴關(guān)系，而DHPW-5在各濃度下均無明顯差別。

巨噬細(xì)胞作為體內(nèi)最大的吞噬細(xì)胞，是組成天然免疫防線的重要組成部分，因此，巨噬細(xì)胞的吞噬能力是評價機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)之一，提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力對巨噬細(xì)胞的免疫功能調(diào)節(jié)具有極其重要的意義。由圖6可知，除DHPW-5外，其他各組多糖對巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響隨著多糖濃度的升高而明顯增強(qiáng)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。DHPW-5在10～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)隨著多糖作用濃度的升高，促巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到50 μg/mL時，多糖作用效果達(dá)到最大值；當(dāng)濃度高于50 μg/mL時，多糖對巨噬細(xì)胞吞噬活性的促進(jìn)作用開始下

降，表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的趨勢。與空白相比，7

2.3 多糖不同組分理化性質(zhì)與免疫活性的關(guān)系

基于上述巨噬細(xì)胞合成NO、分泌TNF-α和IL-1β以及吞噬中性紅能力的變化，采用主成分分析法，對DHPW 7種組分的免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，主成分1主要與NO和TNF-α含量以及吞噬活性相關(guān)，主成分2主要與IL-1β含量相關(guān)。從表3可以看出，按照主成分1排名時，7種組分多糖免疫調(diào)節(jié)活性大小依次是DHPW-2>DHPW-1> DHPW-5>DHPW-4>DHPW-6>DHPW-3>DHPW-7；按主成分2排名時，它們的順序為DHPW-4>DHPW-3>DHPW-5>DHPW-6>DHPW-1>DHPW-2>DHPW-7。這種主成分排名上顯著的差異反映了DHPW各組分對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性各不相同。從綜合得分上看，排名第1的多糖為DHPW-2，其次為DHPW-4，DHPW-1排名第3，DHPW-5、DHPW-3和DHPW-6綜合得分相差較小，分別排在第4、5、6位。7種多糖中，DHPW-7綜合得分最低，表明在7種多糖中DHPW-7對巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力最不理想。

在主成分分析的基礎(chǔ)上，以多糖對巨噬細(xì)胞的免疫活性的影響值為因變量（Y），以Man、Glc、Gal、Glcp14（1，4-D-

Glcp）、Glcp16（1，6-D-Glcp）、Galp1（T-D-Galp）、Glcp146（1，4，6-D-Glcp）、Manp136（1，3，6-D-Manp）、Mw 9種結(jié)種組分多糖在各自最佳質(zhì)量濃度時，巨噬細(xì)胞的吞噬能力相應(yīng)提高了1.56、1.65、1.49、1.42、1.50、1.42和1.37倍。

構(gòu)特征指標(biāo)為自變量（X），采用多元線性回歸的方法分析多糖不同組分的免疫調(diào)節(jié)活性與結(jié)構(gòu)特征之間的關(guān)系，得到如下線性回歸方程：

由此可推測出，多糖對巨噬細(xì)胞NO產(chǎn)量的影響與多糖1，4-D-Glcp和1，3，6-D-Manp含量呈正相關(guān)，與T-D-Galp含量及分子量大小呈負(fù)相關(guān)；誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的活性與Gal、1，4-D-Glcp含量呈正相關(guān)，與1，3，6-D-Manp的含量呈負(fù)相關(guān)；誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β的活性與多糖的Gal及1，4-D-Glcp的含量呈正相關(guān)，與1，4，6-D-Glcp的含量呈負(fù)相關(guān)；刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的活性與1，4，6-D-Glcp和1，3，6-D-Manp的含量呈正相關(guān)，而與分子量大小呈負(fù)相關(guān)。

3 結(jié)論

霍山石斛多糖包含7種分子量和均一度各不相同的組分，它們均由Glc、Man和Gal 3種單糖以1，4-D-Glcp、1，6-D-Glcp、T-D-Galp、1，4，6-D-Glcp、1，3，6-D-Manp連接方式所組成，但各單糖及連接的糖苷鍵類型的組成比例不同。不同組分多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的免疫功能均具有一定的調(diào)節(jié)作用，主成分分析表明，DHPW-2效果最好，DHPW-4次之，DHPW-1排名第3，DHPW-7的免疫調(diào)節(jié)作用一般。多元線性回歸分析結(jié)果表明，不同連接方式的糖苷鍵含量和多糖的分子量對它們的免疫活性具有重要影響。

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