響應(yīng)面法優(yōu)化龍竹竹葉黃酮的提取工藝及抗氧化研究

段麗娜 郭磊 劉超 夏文俊 張永鴻 邱碧麗

摘要 [目的]研究龍竹竹葉黃酮的提取工藝及抗氧化性。[方法]以乙醇為溶劑對(duì)龍竹竹葉黃酮（flavonoids from Dendrocalamus giganteus leaves，簡(jiǎn)稱FDL）進(jìn)行提取，優(yōu)化了提取FDL的工藝參數(shù)，分析黃酮提取物的抗氧化性。[結(jié)果]通過(guò)響應(yīng)面分析得出FDL提取工藝的最佳參數(shù)組合為：浸提溫度74.2 ℃、乙醇濃度79.2%、料液比1.0 ∶36.5（g ∶mL）、浸提時(shí)間3.28 h。在此提取條件下，F(xiàn)DL提取率可達(dá)到721%?？寡趸芯勘砻?，F(xiàn)DL對(duì)DPPH、O2 ·-和 ·OH都具有良好的清除作用。[結(jié)論]龍竹竹葉黃酮是一種可開(kāi)發(fā)的食品抗氧化劑。

關(guān)鍵詞 龍竹；黃酮；提取；響應(yīng)面法；抗氧化

中圖分類號(hào) TS201.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）27-0169-04

Optimization of Extraction Process and Antioxidant of Flavonoids from Dendrocalamus giganteus Leaves by Response Surface Method

DUAN Lina1，GUO Lei2，LIU Chao1 et al

（1.Baoshan Quality and Technical Supervision Comprehensive Testing Center， Baoshan， Yunnan 671000；2.School of Light Industry and Food Engineering， Southwest Forestry University， Kunming， Yunnan 650224）

Abstract [Objective] The research aimed to study the extraction process and antioxidation of flavonoids from Dendrocalamus giganteus leaves. [Method] Flavonoids in Dendrocalamus giganteus levels （FDL） was extracted by ethanol as solvent，the process parameters of FDL extraction were optimized and the antioxidant activity of flavonoid extracts was analyzed.[Result]The optimal parameters of the FDL extraction process were obtained by response surface analysis： extraction temperature 74.2 ℃， ethanol concentration 79.2%， solid-liquid ratio 1.0 ∶365， and extraction time 3.28 h.In the conditions， the extraction ratio of FDL was 7.21%. Antioxidant studies showed that FDL had a good scavenging effect on DPPH， O2 ·- and ·OH.[Conclusion] Flavonoids from Dendrocalamus giganteus leaves is a kind of food antioxidant which can be developed.

Key words Dendrocalamus giganteus；Flavonoids；Extraction；Response surface method；Antioxidant

作者簡(jiǎn)介 段麗娜（1982—），女，云南大理人，工程師，從事食品檢測(cè)和分析研究。*通訊作者，講師，碩士，從事食品資源開(kāi)發(fā)及利用研究。

收稿日期 2018-05-21； 修回日期 2018-06-13

龍竹（Dendrocalamus giganteus Munro）材質(zhì)好，筍味佳，繁殖容易，成林成材迅速，是云南省栽培面積最大、用途最廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的竹種[1]。龍竹主產(chǎn)于滇南、滇西南，生于海拔500～1 500 m的低山、壩區(qū)，滇西北怒江和瀾滄江上游以及滇中金沙江河谷也有分布[2]。

近年來(lái)，人們圍繞竹類主要化學(xué)成分的分析及其提取物開(kāi)發(fā)利用開(kāi)展了大量的研究工作。據(jù)報(bào)道，竹葉提取物的化學(xué)成分包括黃酮及其苷類、多糖類、特種氨基酸及其肽類、芳香成分以及錳、鋅、硒等微量元素，其應(yīng)用價(jià)值可與銀杏相媲美[3]。研究表明，黃酮類化合物是優(yōu)良的自由基清除劑和抗氧化劑，且清除能力的強(qiáng)弱取決于黃酮類化合物的類型和結(jié)構(gòu)，也取決于它們的親脂性和親水性，且對(duì)人類營(yíng)養(yǎng)、健康和老年性疾病的防治有重要意義[4]。

筆者利用響應(yīng)面分析法（response surface methodology，RSM）優(yōu)化FDL的提取工藝獲得最佳的FDL提取工藝條件，并對(duì)FDL進(jìn)行純化來(lái)研究其體外抗氧化性能，為進(jìn)一步提升龍竹竹葉的綜合利用價(jià)值提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

龍竹竹葉（采自西南林業(yè)大學(xué)竹園）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（C27H30O16，純度99%）、無(wú)水乙醇、95%乙醇、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH、石油醚、冰醋酸，以上藥品均為分析純。DPPH、羥自由基測(cè)定試劑盒、抗超氧陰離子自由基以及產(chǎn)生超氧陰離子自由基試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

GZX-9240MBE電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司）、MS205DU電子天平（梅特勒-托利多公司）、數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、UV-2550紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）、BCD-215ADL海爾冰箱（青島海爾股份有限公司）、RE300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）、TDL-40B臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、液-液萃取裝置、真空泵（上海鑫磊真空設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[5-6]。

1.3.2 FDL提取的工藝流程。

龍竹竹葉→預(yù)處理→浸提→過(guò)濾→離心→萃取→濃縮→干燥→成品。

1.3.2.1 預(yù)處理。將所采竹葉清洗干凈后于70 ℃烘箱內(nèi)烘干，取出后用粉碎機(jī)充分粉碎，過(guò)60目篩，將所得竹葉粉裝入棕色磨口瓶備用。

1.3.2.2 離心。將黃酮提取液移至離心管，于離心機(jī)中以4 000 r/min的速度離心10 min，以除去少量葉綠素和其他水不溶性雜質(zhì)。

1.3.2.3 萃取。離心后取上清液加入等體積石油醚充分振蕩，靜置分層后分離收集下層液。反復(fù)萃取直到上層液為無(wú)色或微有顏色為止。收集提取液置棕色瓶中備用[7]。

1.3.3 單因素試驗(yàn)。

以FDL提取率為試驗(yàn)指標(biāo)，研究提取時(shí)間（min）、提取溫度（℃）、料液比（g ∶mL）、乙醇濃度（%）對(duì)FDL提取效果的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)曲面分析方法，選擇單因素試驗(yàn)中對(duì)響應(yīng)值有顯著影響的因素，如選取提取時(shí)間、提取溫度、料液比、乙醇濃度為考察因素，以X1、X2、X3和X4表示，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。利用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件，通過(guò)逐步回歸對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合[8-10]

1.3.5 驗(yàn)證試驗(yàn)。

驗(yàn)證試驗(yàn)包含提取物驗(yàn)證和最佳工藝驗(yàn)證。

1.3.6 FDL對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定。

準(zhǔn)確將FDL配成8種濃度（10、40、80、100、120、160、200、240 μg/mL）。取9支試管，取2 mL DPPH溶液及2 mL FDL溶液加入同一比色管中，同時(shí)取2 mL DPPH及2 mL無(wú)水乙醇作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管，將上述各管放置30 min后，并以VC為參照，在525 nm處測(cè)定吸光度。自由基清除能力計(jì)算公式：K=[1-（A3-A2）/A1]×100，式中，K為清除率；A1為2 mL無(wú)水乙醇加2 mL DPPH溶液的吸光度，A2為2 mL FDL溶液加2 mL無(wú)水乙醇的吸光度，A3為2 mL FDL溶液與2 mL DPPH溶液反應(yīng)后的吸光度。

1.3.7 FDL對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定。

準(zhǔn)確地將FDL配成8種濃度（60、80、100、120、140、180、210、240 μg/mL），并以VC為參照，清除率=[（對(duì)照管-測(cè)定管）/（對(duì)照管-標(biāo)準(zhǔn)管）]×100%。

1.3.8 FDL對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定。

準(zhǔn)確地將FDL配成8種濃度（50、100、200、300、400、500、600、700 μg/mL），并以VC為參照，清除率=[（對(duì)照管-測(cè)定管）/（標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照管-標(biāo)準(zhǔn)空白管）]×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度為縱坐標(biāo)、蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。通過(guò)圖1可知其標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為Y=16.579X+0.003 1（R2=0.999 8）。以此方程計(jì)算提取液黃酮的濃度。

2.3 方差分析

為了檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)FDL提取的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析，并對(duì)各因子進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

一次項(xiàng)中X3的回歸系數(shù)極顯著，說(shuō)明料液比對(duì)FDL提取有極顯著影響；交互項(xiàng)的偏回歸系數(shù)不顯著；提取時(shí)間、提取溫度、料液比和乙醇濃度二次項(xiàng)的偏回歸系數(shù)達(dá)到高度顯著水平。模型具有高度的顯著性（P<0.000 1），且失擬項(xiàng)（P>0.05）不顯著以及R2Adj =0.635 1和S/N（信噪比）為7.952遠(yuǎn)大于4，可知回歸方程擬合度和可信度均很高，試驗(yàn)誤差較小，可用此模型對(duì)FDL提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

經(jīng)過(guò)回歸并優(yōu)化，F(xiàn)DL最佳提取工藝參數(shù)為：浸提溫度74.2 ℃、乙醇濃度79.2%、料液比1.0 ∶36.5、浸提時(shí)間3.28 h。在此最佳工藝條件下，其提取率可達(dá)到7.21%。經(jīng)過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)得出實(shí)際測(cè)得平均提取率為7.18%，其相對(duì)誤差特別小。

2.4 響應(yīng)曲面圖分析

通過(guò)二次多項(xiàng)回歸方程所做的響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖2，該組動(dòng)態(tài)圖可對(duì)任何兩因素交互影響FDL提取率進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，并確定最佳因素范圍。圖2中6個(gè)響應(yīng)面圖分別顯示了提取時(shí)間和提取溫度、提取時(shí)間和料液比、提取時(shí)間和乙醇濃度、提取溫度和料液比、提取溫度和乙醇濃度、料液比和乙醇濃度對(duì)龍竹FDL提取率的交互影響。由圖2可知，提取率隨其中任意2個(gè)變量增加所呈現(xiàn)出來(lái)的趨勢(shì)。對(duì)回歸方程求解并進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得出FDL的最佳提取工藝條件為提取時(shí)間3.28 h、提取溫度74.2 ℃、料液比1.0 ∶36.5、乙醇濃度79.2%，在此提取條件下，黃酮提取率為7.21%。

2.5 FDL對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

由圖3可知，隨著FDL濃度的增加，清除率也逐漸增強(qiáng)，當(dāng)清除率達(dá)到50%時(shí)，F(xiàn)DL濃度為149.17 μg/mL，在同等條件下與對(duì)照組VC比較，在100 μg/mL之前，清除DPPH自由基的能力明顯不足，但隨著FDL濃度的增加，其對(duì)DPPH自由基的清除作用明顯增加，并接近VC。由此可見(jiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)DL對(duì)DPPH自由基有很好的清除作用。

2.6 FDL對(duì)超氧陰離子自由基清除能力的測(cè)定

由圖4可知，當(dāng)FDL濃度增加到250 μg/mL時(shí)，其清除率可達(dá)到5135%以上。同等條件下與VC比較，其對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力相當(dāng)，VC的效果更好一些；隨著FDL濃度的增加，兩者對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用不斷加強(qiáng)。由此說(shuō)明，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著FDL濃度的增加，其對(duì)超氧陰離子的清除作用也逐漸增強(qiáng)，并接近VC。

2.7 FDL對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定

由圖5可知，隨著FDL濃度的增加，其對(duì)羥自由基的清除作用緩慢增強(qiáng)，但當(dāng)其濃度達(dá)到600 μg/mL時(shí)，其清除率就保持在40%左右；同等條件下與VC比較，VC的清除作用明顯較強(qiáng)且一直保持較強(qiáng)的清除力。由此可見(jiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)DL對(duì)羥自由基具有一定的清除作用，與VC比較，其能力明顯不足。

3 結(jié)論與討論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以FDL的提取量為指標(biāo)，通過(guò)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析方法，對(duì)龍竹FDL提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到其最佳提取工藝為浸提溫度74.2 ℃、乙醇濃度79.2%、料液比1.0 ∶36.5、浸提時(shí)間3.28 h。

抗氧化研究表明，龍竹FDL對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基具有較好的清除作用，對(duì)羥自由基具有一定的清除作用。同等條件下與VC比較可知，隨著FDL濃度的增加，其對(duì)自由基的清除作用逐漸加強(qiáng)，并接近VC的清除作用。

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