動(dòng)物肌肉發(fā)育相關(guān)印記基因研究進(jìn)展

賀花 何帆 黃永震 姜艷芬 郭抗抗 王晶鈺 張彥明

摘要 就印記基因的發(fā)展過(guò)程、主要特點(diǎn)及作用機(jī)制進(jìn)行了簡(jiǎn)要概述，并主要介紹了與肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的部分印記基因（DLK1、SNRPN、IGF2和H19），印記基因的作用原理以及對(duì)肌肉發(fā)育的影響。

關(guān)鍵詞 動(dòng)物；肌肉發(fā)育；印記基因；甲基化

中圖分類(lèi)號(hào) S813 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）27-0029-03

Research Progress on Imprinted Gene Related to Development of Animal Muscle

HE Hua1， HE Fan2， HUANG Yongzhen3 et al

（1. College of Veterinary Medicine， Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling， Shaanxi 712100；2. College of Food Science and Engeneering， Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling， Shaanxi 712100；3. College of Animal Science and Technology， Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling， Shaanxi 712100）

Abstract Discovery process， main features and mechanism of action of imprinted genes were summarized.Part of imprinted genes （DLK1，SNRPN，IGF2 and H19） which was associated with the growth and development of animal muscle was introduced. Working principles and its influences to muscles were described.

Key words Animal；Muscle development；Imprinted gene；Methylation

基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31601926）；中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2015M570856）；陜西省博士后科研項(xiàng)目資助基金（2016BSHYDZZ44）；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃一般項(xiàng)目（面上）（2017JM3012）；西北農(nóng)林科技大學(xué)2017年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（S201710712086）。

作者簡(jiǎn)介 賀花（1985—），女，陜西咸陽(yáng)人，實(shí)驗(yàn)師，博士，從事本科教學(xué)實(shí)驗(yàn)室管理和動(dòng)物性食品衛(wèi)生檢驗(yàn)相關(guān)研究。

*與第一作者具有同等的貢獻(xiàn)。

收稿日期 2018-05-31；修回日期 2018-06-15

隨著科學(xué)研究的發(fā)展與進(jìn)步，科學(xué)家們逐漸意識(shí)到并發(fā)現(xiàn)了隱藏在人類(lèi)基因中的一種特殊的基因，即印記基因。研究表明，來(lái)自親本雙方的兩個(gè)等位基因，在遺傳過(guò)程中進(jìn)行了修飾作用，造成了子代中一個(gè)基因表達(dá)而另一個(gè)基因不表達(dá)或表達(dá)不顯著的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象被叫做基因組印記（Genomic Imprinting）。其中，父（母）源印記指的是來(lái)自父（母）方等位基因不表達(dá)者，能產(chǎn)生印記效應(yīng)的單等位表達(dá)基因稱(chēng)為印記基因（Imprinted Genes）。目前對(duì)發(fā)現(xiàn)的少數(shù)印記基因的研究表明，印記基因功能強(qiáng)大且作用很廣泛，該發(fā)現(xiàn)對(duì)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與生物學(xué)都做出了較大貢獻(xiàn)。其中，在動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控因素的研究中，也發(fā)現(xiàn)了印記基因的關(guān)鍵作用，引發(fā)了科學(xué)家在此領(lǐng)域的探索。

1 印記基因的發(fā)現(xiàn)及其特點(diǎn)

1.1 印記基因的發(fā)現(xiàn)

歷史上關(guān)于印記基因現(xiàn)象的最早報(bào)道出現(xiàn)于1960年，Crouse[1]在Sciara昆蟲(chóng)（屬尖眼蕈蚊科尖眼蕈蚊屬，是一種雙翅目的小型昆蟲(chóng)，分布范圍廣，食物來(lái)源繁雜，通常繁殖并生存在畜糞豐富、垃圾多、潮濕及腐殖質(zhì)豐富的地方）的X染色體中發(fā)現(xiàn)，等位基因中來(lái)自于父方的基因不能正常表達(dá)發(fā)揮作用，反而只有來(lái)自于母方的基因可以正常表達(dá)。在此之后，于20世紀(jì)80年代，科學(xué)家在對(duì)小鼠的細(xì)胞進(jìn)行核移植的試驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)了位于哺乳動(dòng)物體內(nèi)染色體上的印記基因。1984年，Barton等[2]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)2個(gè)細(xì)胞核來(lái)自同一個(gè)個(gè)體時(shí)，其只能在初期發(fā)育，到發(fā)育后期就會(huì)死亡；而只有當(dāng)2個(gè)細(xì)胞核來(lái)自2個(gè)不同個(gè)體時(shí)，就得以正常存活并繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育。根據(jù)現(xiàn)在已有的科學(xué)研究得知，同一來(lái)源的2個(gè)細(xì)胞核組成的個(gè)體之所以會(huì)在早期發(fā)育而后期死亡，是由某些印記基因的作用引起的。繼而于20世紀(jì)90年代初，有3個(gè)試驗(yàn)室分別在對(duì)小鼠的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了3種具有重要意義的印記基因，分別是：父源印記基因IGF2、母源印記基因IGF2R和H19。這一發(fā)現(xiàn)是印記基因的研究歷史上的里程碑式的進(jìn)步[3-5]。

大量研究表明，印記基因主要存在于4類(lèi)物種中，分別是真獸類(lèi)哺乳動(dòng)物、有袋類(lèi)動(dòng)物、種子植物和人類(lèi)。2000年，Koski等[6]發(fā)現(xiàn)雞的IGF2基因在其胚胎發(fā)育期間表現(xiàn)出印記現(xiàn)象，同年O Neill等[7]報(bào)道稱(chēng)IGF2基因在雞的胚胎發(fā)育期是父源和母源的2個(gè)等位基因在同時(shí)表達(dá)，而雞的M6 P/IGF2也沒(méi)有出現(xiàn)印記現(xiàn)象。而有關(guān)鳥(niǎo)類(lèi)的印記基因的研究則出現(xiàn)了一些矛盾的現(xiàn)象，因此不能明確其是否真的具有印記基因。通常情況下認(rèn)為魚(yú)類(lèi)、爬行類(lèi)和兩棲類(lèi)（部分鯊魚(yú)也是有胎盤(pán)的）等是不含有印記基因的。

1.2 印記基因的特點(diǎn)

印記基因的特點(diǎn)主要是以下幾個(gè)方面：（1）根據(jù)親本來(lái)源，在來(lái)自父方與母方的等位基因中，僅有一方的等位基因會(huì)表達(dá)，以使來(lái)自?xún)煞降幕蚪M表達(dá)而表現(xiàn)不同的功能；（2）富含CpG島（CpG是胞嘧啶C-磷酸 p-鳥(niǎo)嘌呤 G的縮寫(xiě)，常出現(xiàn)在真核生物編碼基因的調(diào)控區(qū)），十分容易被高度甲基化修飾，表明在印記狀態(tài)的維持上，甲基化修飾發(fā)揮著重要的作用；（3）在DNA基因組上，印記基因很少單獨(dú)存在，而往往是多個(gè)相連著出現(xiàn)，這表明印記基因相互之間存在著某種共線(xiàn)性的作用，因此多個(gè)印記基因的區(qū)域才會(huì)相連出現(xiàn)[8]；（4）印記基因具有印記遺傳的組織特異性，具體來(lái)說(shuō)，在遺傳印記的過(guò)程中，相同的一對(duì)等位基因只在特定的個(gè)體部位表現(xiàn)印記效應(yīng)，即只表達(dá)父源或者母源一方的等位基因，而在另外的組織器官等，兩者都會(huì)表達(dá)，不顯示印記效應(yīng)[9]；（5）目前關(guān)于印記基因的研究，大部分出現(xiàn)于小鼠或者人類(lèi)，可見(jiàn)印記基因具有物種間的保守性[9]；（6）存在包括H19基因在內(nèi)的少量印記基因，它們不會(huì)最終翻譯生成蛋白質(zhì)，但是轉(zhuǎn)錄生成RNA的過(guò)程卻會(huì)發(fā)生[9]；（7）約有15%的印記基因的反義鏈?zhǔn)强梢酝ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)錄生成RNA的，并且這些RNA的生成也屬于遺傳印記，且是父方等位基因的表達(dá)，但不包括Tsix（Xist的反義序列，Xist即X- inactive specific transcript，失活X染色體特定轉(zhuǎn)錄，Tsix為Xist的負(fù)向調(diào)節(jié)因子），其它多數(shù)印記基因的反義鏈都只轉(zhuǎn)錄不翻譯[9]。（8）在DNA的復(fù)制過(guò)程中，印記基因具有復(fù)制時(shí)可以不同時(shí)發(fā)生的特性[10]。

2 印記基因的印記機(jī)制

哺乳動(dòng)物印記基因的印記過(guò)程，一般大致可以分為3個(gè)部分，分別是印記的形成、印記的維持與印記的去除。在哺乳動(dòng)物成熟的配子中，印記已經(jīng)形成，而且印記將持續(xù)存在直到出生以后。有一點(diǎn)值得說(shuō)明的是，在卵母細(xì)胞的核移植試驗(yàn)中，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對(duì)應(yīng)DNA被甲基化修飾后，才可以獲得基因印記，反之則不能獲得。而前文中也有提到過(guò)，對(duì)于印記基因的維持來(lái)說(shuō)，甲基化是一個(gè)必要的因素?；蛴∮浀娜コl(fā)生在原始生殖細(xì)胞的早期階段，而這個(gè)階段中的印記基因的甲基化修飾還在繼續(xù)維持。而在染色體復(fù)制時(shí)，甲基化修飾無(wú)法繼續(xù)維持，因此，母方的去甲基化過(guò)程是被動(dòng)進(jìn)行的。在囊胚階段時(shí)，甲基化修飾會(huì)在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中重新進(jìn)行。在受精時(shí)及受精后，甲基化修飾過(guò)的等位基因?qū)⒗^續(xù)其甲基化狀態(tài)，沒(méi)有被甲基化修飾過(guò)的等位基因?qū)⒗^續(xù)其非甲基化的狀態(tài)。在囊胚期，遺傳印記將建立。而在胚胎期之后，遺傳印記僅出現(xiàn)于各組織器官，原始生殖細(xì)胞中的基因印記將被清除。

3 印記基因的調(diào)節(jié)機(jī)制

3.1 啟動(dòng)子修飾模式

印記基因的啟動(dòng)子中含有大量的鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶，而且其往往在此中的某個(gè)等位基因中是高度甲基化的。該過(guò)程后，啟動(dòng)子無(wú)法和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而抑制該等位基因轉(zhuǎn)錄，繼而抑制基因的表達(dá)。甲基化CpG結(jié)合蛋白2（Methyl CpG binding Protein 2，MeCP2）、組蛋白去乙?；福℉istone deacetylase，HDAC）等構(gòu)成復(fù)合體，在組蛋白H4上，發(fā)生去乙?；揎椷@一過(guò)程，最終使得染色體發(fā)生緊縮，從而基因轉(zhuǎn)錄生成RNA被抑制[10]。

3.2 邊界元件的作用模式

順式阻遏效應(yīng)是許多印記基因差異甲基化區(qū)域（Differentially Methylated Region，DMR）經(jīng)過(guò)甲基化修飾后所具有的，通過(guò)甲基化修飾作用，個(gè)體自身的等位基因就不能夠繼續(xù)表達(dá)，失去了活性。但也有另一種作用效果，對(duì)于部分印記基因DMR來(lái)說(shuō)，甲基化修飾會(huì)活化自身等位基因從而進(jìn)行正常的表達(dá)作用。這一誘導(dǎo)作用主要通過(guò)隔離蛋白與邊界元件之間的作用來(lái)進(jìn)行。例如，隔離蛋白CTCF因子是邊界元件CCCTC序列的基因特異性結(jié)合因子。在交互印記IGF2/H19中，印記中心（Imprinting Center，IC）是一段長(zhǎng)約2 kb的DNA片段，位于IGF2和H19之間。在父方表達(dá)的等位基因中，通過(guò)甲基化修飾IC，由于CTCF因子不再能夠與其正常結(jié)合，因而使增強(qiáng)子優(yōu)先作用于IGF2基因，于是H19基因被抑制正常作用，IGF2基因開(kāi)始表達(dá)。相反，在母方表達(dá)的等位基因中，由于IC沒(méi)有被甲基化修飾，不影響CTCF因子與之正常結(jié)合，因此IGF2基因被抑制轉(zhuǎn)錄，而在H19基因的啟動(dòng)子上增強(qiáng)子發(fā)揮作用，H19基因能夠正常表達(dá)[10]。

4 與動(dòng)物肌肉發(fā)育相關(guān)的印記基因作用機(jī)制及其研究進(jìn)展

4.1 DLK1

DLK1（Delta-like 1 Homologue）是目前已知的印記基因中的其中一種，它表現(xiàn)為父源等位基因表達(dá)而母源等位基因沉默[11]。研究表明，它參與了多種細(xì)胞的增殖、分化調(diào)節(jié)的過(guò)程，發(fā)揮不可忽視的作用[12]。DLK1屬于表皮生長(zhǎng)因子的一種。DLK1與GTL2（Gene Traped Locus 2）是一對(duì)印記基因，人的DLK1基因全長(zhǎng)1 557 bp，編碼序列中含有1 152個(gè)核苷酸，編碼383個(gè)氨基酸殘基[13]。

在DLK1與GTL2這對(duì)印記基因中，DLK1是父源表達(dá)，母源沉默的印記基因（此基因在人、羊、鼠中高度同源）；而GTL2印記基因是僅有母源表達(dá)的。DLK1印記基因定位于人的14號(hào)染色體、小鼠的12號(hào)染色體以及綿羊的18號(hào)染色體[13]。在人14號(hào)染色體上，目前已知DKL1印記基因有3個(gè)DMR區(qū)域，分別是DKL1基因3端的DMR區(qū)域，位于GTL2基因上游15 Kb的基因間差異甲基化區(qū)以及包括了GTL2基因的啟動(dòng)子和第一外顯子的DMR區(qū)域[14]。這些甲基化區(qū)域調(diào)控著該基因印記的表達(dá)，決定了一對(duì)等位基因是由父源表達(dá)還是由母源表達(dá)。例如，位于小鼠12號(hào)染色體上的DKL1基因表達(dá)的是父源等位基因，由該基因編碼合成是一種跨膜糖蛋白，與Delta/Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，能夠維持細(xì)胞的正常分化和增殖[15]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，DLK1基因的作用機(jī)制與GTL2基因是緊密聯(lián)系的，與位于小鼠7號(hào)染色體上的印記基因組IGF2/H19作用機(jī)制十分相似[10]。DLK1和IGF2基因同樣都是在去甲基化修飾過(guò)程后，表達(dá)作用被抑制，從而間接地促進(jìn)了GTL2基因和H19基因的表達(dá)[13]。

研究表明，DLK1基因能夠調(diào)節(jié)肌細(xì)胞和人骨骼肌干細(xì)胞的分化，并且在胎盤(pán)類(lèi)哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，對(duì)肌肉的發(fā)育有促進(jìn)作用，而抑制脂肪組織的生長(zhǎng)[16-17]。

4.2 SNRPN

SNRPN（encode Small Nuclear Ribonucleoprotein Polypeptide N）基因是編碼小核核糖核蛋白多肽N的印記基因，其作用是與前體RNA結(jié)合，從而影響RNA的選擇性剪接[18]。SNRPN基因在鼠和人中均為父源等位基因表達(dá)[19-20]，其在鼠的肺、肝、脾、腎、子宮、睪丸和腦等組織器官中都有表達(dá)，但在腦中表達(dá)量最高[21]。另一研究發(fā)現(xiàn)，仔豬的SNRPN基因在心臟、肌肉中的表達(dá)量均低于其他組織，心臟中的表達(dá)量較低這一現(xiàn)象在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中可能存在著種間差異[22]。人的SNRPN基因定位于染色體15 q11-q13的PWS/AS區(qū)域[18]，Glenn等[23]通過(guò)Northern Blot試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SNRPN在腦的不同部位都高表達(dá)，包括下丘腦，這表明SNRPN基因在下丘腦中極有可能發(fā)揮了重要的不可替代的作用。在對(duì)人和鼠中的研究試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，該印記基因異常表達(dá)時(shí)是會(huì)影響到個(gè)體神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育進(jìn)程的。同時(shí)相關(guān)研究表明，在豬中該基因在神經(jīng)系統(tǒng)中高度表達(dá)，這說(shuō)明該基因?qū)ι窠?jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有著重要影響和作用[22]，而到個(gè)體成年時(shí)，其各組織器官中該基因的表達(dá)達(dá)到了相對(duì)穩(wěn)定，只有在心臟、骨骼肌中的表達(dá)量是略微低于其他組織器官中的表達(dá)量的[24]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)SNRPN基因在豬的各個(gè)時(shí)期的胎盤(pán)中都能夠穩(wěn)定表達(dá)，沒(méi)有大的起伏和變動(dòng)，這可能與SNRPN基因的功能有一定關(guān)系[22]。還有研究表明該基因同時(shí)與細(xì)胞的分化、細(xì)胞的增殖、胚胎的發(fā)育以及一些精神行為等有關(guān)聯(lián)[25-28]。由此可見(jiàn)，SNRPN基因不僅在胎盤(pán)功能和仔豬生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，而且在肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中也起到了重要作用。

同樣在下丘腦中高度表達(dá)的還有NDN（Necdin）基因和UBE3A（Ubiquitin-protein ligase E3A）基因，雖然在肌肉中表達(dá)量較低，但也發(fā)揮了作用，促進(jìn)生長(zhǎng)[22]。

4.3 IGF2和H19

IGF2（Insulin-like Growth Factor 2）基因是胰島素樣生長(zhǎng)因子之一，主要在胎兒的發(fā)育時(shí)期、腫瘤細(xì)胞的增殖分化時(shí)期以及肌肉的生長(zhǎng)方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。由于IGF2基因與肌肉的生長(zhǎng)密切相關(guān)，因此該基因是影響豬胴體瘦肉率和背膘厚度的基因中重要的候選基因之一[29]，與之相關(guān)的試驗(yàn)也進(jìn)一步說(shuō)明了IGF2基因?qū)∪馍L(zhǎng)的關(guān)鍵影響。研究表明，15～23周齡的公豬，其IGF2基因印記濃度與背膘厚度呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明IGF2基因?qū)τ谥窘M織的積累有反向調(diào)節(jié)作用[30]。1986年，F(xiàn)lorini等[31]提出了IGF2基因的作用方式是通過(guò)對(duì)濃度的控制達(dá)到促進(jìn)肌纖維的增殖和分化的目的。

H19基因位于IGF2基因的下游，只轉(zhuǎn)錄RNA，而不翻譯形成蛋白質(zhì)，是母源表達(dá)、父源沉默的印記基因，H19基因是以轉(zhuǎn)錄形成RNA的形式來(lái)發(fā)揮功能和作用的，一般認(rèn)為H19基因參與了IGF2基因的表達(dá)調(diào)控[32-34]。研究發(fā)現(xiàn)，H19和IGF2基因是一對(duì)相互影響的印記基因組。在H19基因作用時(shí)，其抑制了母源染色體的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而降低了IGF2印記的濃度[29]。

通過(guò)對(duì)瘦肉型品種長(zhǎng)白豬和脂肪型品種藍(lán)塘豬的研究，可得知IGF2基因和H19基因在豬脂肪沉積和生長(zhǎng)發(fā)育上發(fā)揮了重要作用和影響，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其在豬早期的肌肉等組織的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起到了重要作用，證實(shí)了IGF2基因和H19基因與動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，從而發(fā)揮關(guān)鍵性作用[28-29]。

5 印記基因應(yīng)用前景

盡管印記基因的數(shù)量只占人體基因總數(shù)的很小的比例，但它們的表達(dá)會(huì)對(duì)個(gè)體的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程都有著重要影響，由此來(lái)看，印記基因的作用研究無(wú)疑將會(huì)是未來(lái)研究的重點(diǎn)。相信在生命科學(xué)技術(shù)日益發(fā)展和完善的今天，印記基因的研究與應(yīng)用將成為科學(xué)家們的又一熱門(mén)研究領(lǐng)域。除了生長(zhǎng)發(fā)育，如果能在成體組織中對(duì)印記基因功能進(jìn)行更深入的分析，或許將有助于了解動(dòng)物遺傳疾病、腫瘤等的發(fā)病機(jī)理，并使這些疾病能夠得到一定的解決或改善。

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