紫花三叉小白芨組培快繁技術(shù)研究

高燕 姜艷 李薇莎 李澤生 李桂琳 白燕冰 羅凱 周侯光

摘要[目的]確定白芨種子萌發(fā)的最適培養(yǎng)基，以及種子萌發(fā)后在自然光培養(yǎng)下叢生芽誘導(dǎo)分化及生根的最佳條件。[方法]選擇成熟白芨果莢為外植體，采用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)白芨種子誘導(dǎo)、增殖、生根等問(wèn)題進(jìn)行試驗(yàn)研究。[結(jié)果]白芨種子誘導(dǎo)最適宜培養(yǎng)基為1/2MB+馬鈴薯泥20 g/L +蔗糖20 g/L，誘導(dǎo)率為95%；增殖分化培養(yǎng)基為1/2MB+馬鈴薯泥50 g/L+香蕉泥20 g/L+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L +蔗糖25 g/L+艾蒿葉干粉2 g/L，增殖系數(shù)為14.2倍；生根培養(yǎng)基為1/2MB+香蕉泥80 g/L +NAA 0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+艾蒿葉干粉4 g/L，生根率達(dá)100%。[結(jié)論]白芨組培快繁能培養(yǎng)出帶根莖葉的小植株，移栽成活率可達(dá)95%，為白芨產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞白芨；無(wú)菌播種；快繁技術(shù)

中圖分類號(hào)S503.53文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）05-0114-03

Abstract[Objective] The research aimed to determine the optimal medium for seed germination of Bletilla striata，the best conditions for inducing differentiation and rooting of multiple shoots under natural light.[Method]The mature Bletilla striata fruit pod was selected as explant， and the tissue culture technique was used to study the inducement， proliferation and rooting of Bletilla striata seed.[Result]The optimum culture medium for Bletilla striata seed induction was 1/2MB+mashed potatoes 20 g/L + sucrose 20 g/L， and the induction rate was 95%. The proliferation differentiation medium was 1/2MB+ mashed potatoes 50 g/L+ mashed banana 20 g/L+6BA 0.4 mg/L +NAA 0.1 mg/L +sucrose 25 g/L +Artemisia argyi leaves dry powder 2 g/L， the multiplication coefficient was 14.2. The rooting medium was 1/2MB+ mashed banana 80 g/L+ NAA 0.5 mg/L+ sucrose 20 g/L+Artemisia leaves dry powder 4 g/L，and the rooting rate was 100%.[Conclusion]Rapid propagation of tissue culture of Bletilla striata can cultivate plants with rhizomes and leaves， the survival rate of transplanting can reach 95%， which provides technical support for the industrialization development of Bletilla striata.

Key wordsBletilla striata；Sterile seeding；Rapid propagation

白芨[Bletilla striata（Thunh.）Reichb.f.]是蘭科白芨屬多年生草本塊莖植物，別名紫蘭根，李時(shí)珍釋其名：其根白色，連及而生，故曰白芨[1]；白芨花色有紫花、白花、黃花，花色艷麗，是一種觀賞價(jià)值極高植物[2]，具有收斂止血、消腫生肌等功效[3-4]。近年來(lái)，白芨不僅作為傳統(tǒng)中草藥，由于其中含較高的白芨膠可替代阿拉伯膠等膠劑作為混懸劑及乳化劑，廣泛用于食品及化工領(lǐng)域[5]，還因其觀賞價(jià)值極高被大家喜愛。因此，白芨的需求量急劇增加，價(jià)格逐漸遞增，2016年突破800元/kg。野生資源遭到過(guò)度采挖，資源急劇減少，瀕臨滅絕，現(xiàn)已被國(guó)家列為重點(diǎn)保護(hù)的野生藥用植物之一。由于白芨種子非常細(xì)小且又無(wú)胚乳，在自然條件下很難萌發(fā)和生長(zhǎng)，實(shí)生苗的栽培較為困難，傳統(tǒng)栽培主要靠分株繁殖[6-7]，但分株繁殖周期長(zhǎng)，效率低，耗種量大，難滿足市場(chǎng)需求。為了保護(hù)白芨野生資源，保護(hù)生物多樣性，人工培育和栽培白芨迫在眉睫。白芨蒴果無(wú)菌播種技術(shù)已基本成熟[8-9]，但馴化栽培成活率較低瓶頸難以突破。為了探索白芨組培苗馴化栽培最佳途徑，筆者于2015—2017年，采用從紅河冷泉引進(jìn)的紫花三叉小白芨移栽后，開展人工授粉、無(wú)菌播種、自然光下增殖和生根培育、移栽等關(guān)鍵技術(shù)的試驗(yàn)研究，為白芨產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

紫花三叉小白芨種源是從紅河冷泉引進(jìn)栽培于云南省德宏熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所引種圃，4—5月開花盛期選取健壯的母株進(jìn)行人工授粉，授粉后套袋，7～10 d花調(diào)謝，8—9月為蒴果成熟期。測(cè)定果重0.55～1.01 g，果長(zhǎng)2364～32.66 mm，果直徑7.87～10.90 mm，種胚長(zhǎng)0.448 mm，寬0.157 mm（圖1～2）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1無(wú)菌播種。

選發(fā)育正常飽滿成熟未開裂的蒴果，用0.1%洗潔精洗凈，置于超凈工作臺(tái)上，用75%酒精消毒60 s，再用0.1%HgCl2滅菌15 min，然后用無(wú)菌水沖洗5～6次，過(guò)濾紙吸干水分，酒精燈烘烤蒴果表皮，切開蒴果，將種子播種于不同基本母液及不同添加物培養(yǎng)基上，采用基本母液MS改良為MB（無(wú)水氯化鈣和硝酸鉀減半、肌醇不用），每種培養(yǎng)基均勻播種5瓶，pH為5.8～6.0，培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度1 800～2 000 lx，光照時(shí)間8～10 h/d，培養(yǎng)50 d后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.2.2繼代增殖分化培養(yǎng)。

將種子萌發(fā)形成的原球莖接種于繼代增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以1/2MB為基本培養(yǎng)基，添加馬鈴薯泥50 g/L和香蕉泥20 g/L及不同濃度的6-BA和NAA，共9種，每種培養(yǎng)基接種5瓶，用封口膜封2.0～2.5圈。將繼代增殖分化培養(yǎng)瓶苗置于搭建好的塑料大棚內(nèi)梯形多層培養(yǎng)架上進(jìn)行自然光培養(yǎng)，用白色塑料薄膜遮蓋培養(yǎng)瓶，蔭蔽度為70%～80%，培養(yǎng)溫度22～30 ℃，培養(yǎng)60 d后，統(tǒng)計(jì)增殖倍數(shù)。

1.2.3壯苗生根培養(yǎng)。

將叢生芽分切割單芽，株高達(dá)到3 cm以上接種到不同有機(jī)物組合及NAA 0.5 mg/L的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，共4種，每種壯苗生根培養(yǎng)基接種5瓶，將瓶苗置于自然光下搭建好塑料大棚苗床上培養(yǎng)，蔭蔽度為60%～70%，溫度控制在30 ℃以下，煉苗培養(yǎng)60 d后，統(tǒng)計(jì)株高、生根數(shù)量、生根長(zhǎng)度。

1.2.4移栽。

將株高5～7 cm生根苗取出，用清水洗干凈根部的培養(yǎng)基，置于0.1%高錳酸鉀或1 000倍多菌靈溶液中浸泡5～10 min，撈出晾干至根發(fā)白，移栽于5種不同基質(zhì)中（腐熟艾蒿、腐熟鋸木渣、腐質(zhì)土、火燒土不同體積比），株行距5 cm×5cm，蔭蔽度70%～80%，濕度60%～70%，溫度控制在30 ℃以下。移栽后10～15 d結(jié)合澆水施沼液肥。

2結(jié)果與分析

2.1不同基本母液對(duì)白芨種胚萌發(fā)率的影響

采用白芨4～5個(gè)月基本成熟的種胚，以不同基本培養(yǎng)基（1/2MS、MS、1/2MB、MB、N6、B5、花寶1號(hào)）上萌發(fā)培養(yǎng)，白芨種子無(wú)菌播種10～15 d后，種子慢慢吸水膨大，由黃褐色變成綠色，30 d后誘導(dǎo)大量原球莖，50 d后原球莖發(fā)出綠色芽尖。由表1可知，白芨種胚在基本培養(yǎng)基中，1/2MB種胚萌發(fā)率最高為90%，生長(zhǎng)快，原球莖粗壯；1/2MS種胚萌發(fā)率較高，為88%；MS和MB種胚萌發(fā)率最低，原球莖分化少；N6、B5、花寶1號(hào)種胚萌發(fā)率略低，但原球莖長(zhǎng)得較粗壯。

2.2不同添加物對(duì)白芨種胚萌發(fā)的影響

由表2可知，在1/2MB培養(yǎng)基中添加馬鈴薯泥20 g/L、香蕉泥20 g/L、艾蒿葉2 g/L的不同添加物對(duì)種胚均有較高萌發(fā)率，分別為95%、92%、93%，高于對(duì)照（CK）90%；但在培養(yǎng)基中添加西瓜汁20 g/L、番茄汁20 g/L、活性炭2 g/L對(duì)種胚萌發(fā)率較低，分別為86%、88%、89%，由于艾蒿葉成本低，對(duì)種胚萌發(fā)快，苗粗壯，有利于白芨規(guī)?；a(chǎn)時(shí)降低成本?？梢?，在原球莖增殖分化培養(yǎng)基中添加適量濃度的有機(jī)添加物（馬鈴薯泥、香蕉泥、艾蒿葉）對(duì)種胚的萌發(fā)有促進(jìn)作用。

2.3不同植物激素組合對(duì)白芨增殖分化的影響

將種子萌發(fā)的分化幼苗接種于添加不同植物激素配比的培養(yǎng)基中，12 d后從幼苗假鱗莖基部長(zhǎng)出小芽，小芽不斷分蘗長(zhǎng)出叢生芽。由表3可知，9種增殖分化培養(yǎng)基中，以A5處理（1/2MB+馬鈴薯泥50 g/L+香蕉泥20 g/L+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L+蔗糖25 g/L+艾蒿葉干粉2 g/L培養(yǎng)基）誘導(dǎo)效果最好，增殖倍數(shù)最高，為14.2倍，分化的小苗整齊均勻，葉片厚、深綠色，生長(zhǎng)快而粗壯。當(dāng)6-BA濃度為0.6 mg/L時(shí)，分化的小苗假磷莖較多，分化的小苗葉片細(xì)長(zhǎng)，再分化能力變?nèi)酢?/p>

2.4艾蒿、活性炭和香蕉泥對(duì)白芨生根苗的影響

將長(zhǎng)至高3 cm以上的幼苗接種到不同有機(jī)物組合培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，從表4可知，4種生根培養(yǎng)基中，以B1處理（1/2MB+NAA 0.5 mg/L+艾蒿葉干粉4 g/L+香蕉泥80 g/L培養(yǎng)基）誘導(dǎo)生根效果最好，平均株高8.6 cm，平均莖粗0.28 cm，平均生根數(shù)4.2條，平均根長(zhǎng)3.5 cm，生根苗粗壯，葉片舒展，根系多而粗壯；其次，以B3添加活性炭培養(yǎng)基誘導(dǎo)生根效果較好，平均株高7.2 cm，平均莖粗0.26 cm，平均生根數(shù)3.9條，平均根長(zhǎng)3.3 cm；當(dāng)香蕉泥濃度為40 g/L時(shí)，生根苗明顯變細(xì)弱，說(shuō)明艾蒿和香蕉泥對(duì)白芨生根均有顯著促進(jìn)作用，且對(duì)幼苗的生長(zhǎng)也有一定的促進(jìn)作用。添加活性炭的培養(yǎng)基上幼苗較高，根系較長(zhǎng)，活性炭會(huì)吸附培養(yǎng)基中由白芨生長(zhǎng)代謝產(chǎn)物的有毒物質(zhì)，也會(huì)吸附部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可見活性炭對(duì)生根有抑制作用；而添加香蕉泥培養(yǎng)基上幼苗和根系明顯粗壯?？梢?，艾蒿有利于根莖伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，香蕉泥更有利于根莖橫向生長(zhǎng)，兩者的合理組配是培養(yǎng)白芨生根苗的關(guān)鍵。

2.5不同基質(zhì)比體積對(duì)移栽成活率的影響

白芨生根苗在自然光下培養(yǎng)70 d，葉片厚大、舒展，葉色轉(zhuǎn)深綠色，基部產(chǎn)生小球莖、粗壯，白色根增多、粗壯。由表5可知，以處理C5腐熟艾蒿∶腐熟鋸木渣∶腐質(zhì)土∶火燒土（1∶2∶4∶3）比體積的復(fù)合基質(zhì)最好，移栽成活率達(dá)94.7%，生長(zhǎng)抽芽快。

3討論與小結(jié)

在白芨組織培養(yǎng)快繁過(guò)程中，種子萌發(fā)時(shí)，原球莖在MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，在改良的1/2MB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，說(shuō)明高濃度的無(wú)機(jī)鹽對(duì)原球莖的增殖分化有抑制作用，該試驗(yàn)結(jié)果與袁寧等[10]的研究結(jié)果相符合。無(wú)菌播種獲得原球莖如不及時(shí)轉(zhuǎn)接到增殖分化培養(yǎng)基中，原球莖很快分化呈小苗，影響分化率；在種子萌發(fā)時(shí)，添加不同的有機(jī)物，白芨種子萌發(fā)、出苗情況也不同，其中以馬鈴薯效果最佳，艾蒿葉次之，西瓜汁最差，這與張燕等[11-12]報(bào)道的相同。在顯微鏡下觀察，白芨種子的種胚比石斛蘭種子的種胚要大且飽滿，積累的營(yíng)養(yǎng)成分更多，白芨的胚萌發(fā)直接分化長(zhǎng)成小苗，這與張建霞等[13]報(bào)道的相同。

在原球莖增殖分化培養(yǎng)基中添加適量濃度馬鈴薯泥、艾蒿葉和香蕉泥不同組合對(duì)種胚的萌發(fā)有促進(jìn)作用，采用6-BA和NAA不同濃度的組合對(duì)叢生芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，以6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L組合增殖誘導(dǎo)效果最好，增殖系數(shù)為14.2倍，增殖分化苗在自然光下培養(yǎng)60 d，葉片深綠色，假鱗莖上分化的幼苗明顯增多；NAA是影響白芨生根的主要原因，NAA濃度過(guò)高，生根苗易黃化，褐化嚴(yán)重，易出現(xiàn)畸形苗，NAA濃度過(guò)低，對(duì)白芨組培苗的生根率、生根數(shù)、根的粗細(xì)有直接影響，在培養(yǎng)基中添加NAA 0.5 mg/L生根誘導(dǎo)效果較好。艾蒿具有抗菌和抗病毒作用，在培養(yǎng)基中添加艾蒿葉對(duì)白芨種子的萌發(fā)、增殖分化、生根有一定促進(jìn)作用，艾蒿在培養(yǎng)的過(guò)程中是否對(duì)污染率也有所降低還有待進(jìn)一步研究。

白芨生根苗的質(zhì)量是影響移栽成活率的重要因素，選擇健壯的生根苗，能提高移栽成活率，達(dá)到預(yù)期的效果。在該

研究中，通過(guò)對(duì)不同生根瓶苗在不同的環(huán)境條件下培養(yǎng)及移栽于不同基質(zhì)比體積中進(jìn)行系統(tǒng)比較，結(jié)果表明，生根瓶苗在自然環(huán)境條件下培養(yǎng)60 d，隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，白芨幼苗假鱗莖隨著增大，移栽成活率最高，主要是因?yàn)榘总干棵缭谧匀还獬渥愕沫h(huán)境下培養(yǎng)，溫濕度是影響白芨生長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，溫濕度過(guò)大幼苗易黃化，甚至腐爛，溫度超過(guò)30 ℃，需要加蓋遮陽(yáng)網(wǎng)，大棚注意通風(fēng)及噴水降溫，雨季要搭建拱棚防雨，減少污染。

由于光照充足，幼苗基部易形成假鱗莖多而大，葉片變寬大而厚，植株粗壯，脫瓶清洗時(shí)，幼苗假鱗莖呈叢生狀態(tài)，根系粗壯，移栽成活率較高。采用腐熟艾蒿∶腐熟鋸木渣∶腐質(zhì)土∶火燒土（1∶2∶4∶3）比體積的復(fù)合基質(zhì)移栽，保肥、保水性好，移栽成活率達(dá)94.7%。

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