固定化四爿藻的制備及其去除養(yǎng)殖廢水中氮?磷的效果

李陳清 王珺 陳國(guó)華 梁業(yè)松 梁俊 海靖濤

摘要[目的]探究固定化四爿藻去除養(yǎng)殖廢水中氨氮（NH4+-N）、亞硝酸氮（NO2--N）和活性磷酸鹽（PO43--P）的效果。[方法]采用海藻酸鈉固定化包埋技術(shù)開(kāi)展了四爿藻固定化培養(yǎng)，探究了藻球直徑、藻細(xì)胞包埋密度、海藻酸鈉濃度及氯化鈣濃度等條件對(duì)四爿藻固定化培養(yǎng)的影響。同時(shí)測(cè)定了固定化四爿藻去除養(yǎng)殖水體中NH4+-N、NO2--N、PO43--P的效果。[結(jié)果]四爿藻固定化培養(yǎng)的優(yōu)化條件為藻球直徑為4 mm、藻細(xì)胞包埋密度為1.82×104個(gè)/mL、海藻酸鈉質(zhì)量濃度為10 g/L及氯化鈣濃度為20 g/L；在石斑魚(yú)養(yǎng)殖廢水中引入固定化四爿藻，試驗(yàn)第3天，NH+4-N去除率達(dá)98.87% 、NO2--N去除率達(dá)98.33%和PO43--P去除率達(dá)83.70%。[結(jié)論]采用海藻酸鈉固定化包埋技術(shù)不影響四爿藻的生理活性；固定化四爿藻應(yīng)用于凈化養(yǎng)殖水環(huán)境具有很好的前景。

關(guān)鍵詞四爿藻；固定化；氮；磷；去除率

中圖分類號(hào)X703文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）05-0081-04

Abstract[Objective]To investigate the effects of immobilized Tetraselmis chui on removing nitrogen（N） and phosphorus（P） from aquaculture wastewater. [Method]Embedding carry of sodium alginate was used to immobilize microalga Tetraselmis chui， and then studied the effects of embedded microalgal particle diameter， cell density of embedded microalgae， concentrations of sodium alginate and calcium chloride on the cultivation of immobilized Tetraselmis chui. [Result]The effects of immobilized Tetraselmis chui was with immobilized microalgal particle diameter of 4 mm，immobilized Tetraselmis chui on removing NH4+N， NO2-N and PO43-P from aquaculture wastewater were also investigated. The results showed that the optimal cultivation condition of 1.82×104 cells/mL embedded cell density， 10 g/L sodium alginate， and 20 g/L CaCl2. Furthermore， the immobilized Tetraselmis chui was also used for the treatment of grouper breeding wastewater，and the removal efficiencies of NH4+N、NO2-N and PO43-P reached 98.87%， 98.33%， and 83.70% on the third day， respectively. In conclusion， the immobilization technology with sodium alginate had no impacts on the physiological activity of Tetraselmis chui. [Conclusion]Thus， immobilized Tetraselmis chui has potential to be applied in the treatment of aquaculture wastewater.

Key wordsTetraselmis chui；Immobilization；N；P；Removal rate

細(xì)胞固定化技術(shù)是將游離的細(xì)胞固定或包埋在載體上，細(xì)胞同載體處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)的一種化學(xué)處理工藝[1]。藻類固定化技術(shù)起始于20世紀(jì)80年代，早期主要應(yīng)用于生化生產(chǎn)和能源提供[2]。在環(huán)境領(lǐng)域主要應(yīng)用于廢水處理和生物監(jiān)測(cè)，具有反應(yīng)速度快、固液分離效果好、運(yùn)行穩(wěn)定性高等特點(diǎn)[3-4]。目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有較多研究。如孫杰等[5]在西施舌（Coelomactra antiquata）人工育苗中應(yīng)用固定化海洋微藻可有效吸收降解養(yǎng)殖環(huán)境中的氨氮與亞硝酸氮，改善水質(zhì)，提高苗種的成活率與生長(zhǎng)量；黃翔鵠等[6-7]研究表明，固定化波吉卵囊藻和微綠球藻可改善凡納對(duì)蝦養(yǎng)殖水質(zhì)，并提高對(duì)蝦抗病力。鄭蓮等[8]研究表明，固定化微綠球藻可有效降低對(duì)蝦養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸氮等有害因子的濃度，同時(shí)能抑制弧菌的生長(zhǎng)，提高水中溶解氧含量，使水體長(zhǎng)時(shí)間保持較好的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

四爿藻（Tetraselmis chui）隸屬于綠藻門綠藻綱團(tuán)藻目衣藻科四爿藻屬，是一種增殖速度很快的單細(xì)胞綠藻，能進(jìn)行光合放氧作用，并含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是魚(yú)、蝦幼體和貝類的優(yōu)良餌料[9-10]。氮和磷是藻類細(xì)胞的主要營(yíng)養(yǎng)成分，藻細(xì)胞通過(guò)吸收環(huán)境中的氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而不斷增殖[11]。因此，某種微藻的增殖與其吸收環(huán)境中的氮、磷成正比。影響固定化微藻生長(zhǎng)和氮、磷去除效率的內(nèi)部因素主要是藻種本身生理特征，外部因素主要包括溫度、光照、營(yíng)養(yǎng)條件、藻球規(guī)格大小、藻細(xì)胞包埋量、藻球用量等方面[12]。筆者以四爿藻為藻種，采用海藻酸鈉包埋技術(shù)進(jìn)行固定化，進(jìn)行了不同藻球規(guī)格、接種密度、海藻酸鈉濃度及氯化鈣濃度等培養(yǎng)條件對(duì)固定化四爿藻生長(zhǎng)及去除養(yǎng)殖廢水中氨氮（NH4+-N）、亞硝酸氮（NO2--N）和活性磷酸鹽（PO43--P）的效果，以期為固定化四爿藻應(yīng)用于養(yǎng)殖廢水處理提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試四爿藻取自海南大學(xué)海洋學(xué)院，原種于2016年4月取自海南省陵水縣自然海區(qū)，經(jīng)過(guò)微吸管法分離、提純，擴(kuò)大培養(yǎng)后備用。

1.2微藻培養(yǎng)條件

培養(yǎng)液采用“寧波大學(xué)3號(hào)”微藻培養(yǎng)液配方[13]；培養(yǎng)容器為1 000 mL“晶花牌”三角燒瓶；試驗(yàn)用海水取自?？谑邪咨抽T自然海區(qū)，經(jīng)過(guò)400目篩絹網(wǎng)及脫脂棉過(guò)濾、煮沸、自然冷卻后使用。培養(yǎng)條件：溫度（26±2） ℃，鹽度為31.5，pH 8.04，光照度為4 000 lx，光暗周期14 h∶10 h，不充氣，每天搖瓶4次，提供碳源及氧氣，以保證微藻正常生長(zhǎng)。該試驗(yàn)選用石斑魚(yú)苗養(yǎng)殖廢水，各試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)平行組。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1

固定化藻膠球的制備方法。稱取不同質(zhì)量的海藻酸鈉，分別與500 mL蒸餾水混合，加入10 g氯化鈉，在 100 ℃ 水浴中分別溶解制成10%、20%和30%海藻酸鈉膠體溶液。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的四爿藻與海藻酸鈉膠體溶液分別按1∶4混合均勻，然后用不同規(guī)格的注射器將其滴入常溫的2% CaCl2 溶液中，即形成不同直徑的四爿藻膠球，靜置1 h后，用消毒海水洗滌3次，備用。

1.3.2

固定化藻球脫固定化方法。在測(cè)定固定化藻細(xì)胞密度時(shí)需先脫固定化，將固定化四爿藻膠球加入盛有一定量5%檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7）化解液的小試管中，搖動(dòng)，使固定化藻球完全溶解成懸浮狀，再用甲醛固定，然后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)藻細(xì)胞密度，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次，取平均值。

1.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1

藻膠球直徑的篩選試驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌條件下，用不同規(guī)格的針頭滴成不同大小的藻球，膠球直徑大小分別為 2、3、4、5 mm。培養(yǎng)于500 mL三角瓶中，并加入300 mL培養(yǎng)液，接種400粒膠藻球進(jìn)行固定化培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d后測(cè)定其細(xì)胞密度。

1.4.2

藻細(xì)胞接種量密度試驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌條件下，制備海藻酸鈉與四爿藻混合液的終藻細(xì)胞密度分別為1.82×102、1.82×103、1.82×104和1.82×105個(gè)/mL。培養(yǎng)于500 mL三角瓶中，并加入300 mL培養(yǎng)液，接種400粒膠藻球進(jìn)行固定化培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d后測(cè)定其細(xì)胞密度。

1.4.3

海藻酸鈉與氯化鈣不同濃度的正交試驗(yàn)。在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取藻球在海水中維持穩(wěn)定10 d以上的條件，設(shè)計(jì)海藻酸鈉與氯化鈣2因素3水平的正交試驗(yàn)（表1），得出最佳的海藻酸鈉與氯化鈣濃度配比。培養(yǎng)于500 mL三角瓶中，并加入300 mL培養(yǎng)液，接種400粒膠藻球進(jìn)行固定化培養(yǎng)，培養(yǎng)15 d后測(cè)定其細(xì)胞密度。

1.4.4

固定化四爿藻應(yīng)用于凈化水質(zhì)試驗(yàn)。采用上述試驗(yàn)得到優(yōu)化的固定化條件制作藻球，培養(yǎng)于盛有1 L石斑魚(yú)苗養(yǎng)殖廢水的2 L三角瓶中，每組投放藻球1 000粒，光照度為4 000 lx，光暗周期14 h∶10 h，水溫為（26±2） ℃。每天09：00—10：00定時(shí)取水樣，用0.45 μm 濾膜真空抽濾，測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。其中，氨氮（NH4+-N）含量采用次溴酸鈉氧化法測(cè)定；亞硝酸氮含量（NO2--N）采用重氮-偶氮法測(cè)定；活性磷酸鹽（PO43--P）含量采用磷鉬藍(lán)分光光度法測(cè)定。具體方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[14]，共測(cè)定7 d。

1.5相關(guān)計(jì)算

1.5.1

藻膠球破碎率。將固定化四爿藻藻球接入廢水中培養(yǎng)，不通氣的情況下，每天數(shù)出破碎藻球的個(gè)數(shù)，破碎藻球與總球數(shù)之比即破碎率，培養(yǎng)計(jì)數(shù)10 d。

1.5.2

氮、磷去除率（R）。按下式計(jì)算：

R=（C0-Ct）/C0 ×100%

式中，C0為各種形態(tài)氮、磷的初始濃度（mg/L）；Ct為取樣時(shí)氮、磷濃度（mg/L）。

1.5.3

生長(zhǎng)速率（K）。根據(jù)下式計(jì)算：

K=（lgBt-lgB0）/t

式中，B0為接種初始藻細(xì)胞密度；Bt為經(jīng)過(guò)t時(shí)間培養(yǎng)后的藻細(xì)胞密度；t為培養(yǎng)時(shí)間（d）。

1.6統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表生成，運(yùn)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，并采用Duncan進(jìn)行多重比較。

46卷5期李陳清等固定化四爿藻的制備及其去除養(yǎng)殖廢水中氮·磷的效果

2結(jié)果與分析

2.1膠球直徑對(duì)固定化四爿藻培養(yǎng)的影響

由表2可知，4種不同藻球直徑的生長(zhǎng)率分別為0.142、 0.146、0.148、0146，直觀分析可知直徑為4 mm的藻球生長(zhǎng)率最高。利用SPSS 17.0軟件對(duì)其進(jìn)行單因子方差分析，結(jié)果表明該試驗(yàn)設(shè)計(jì)的藻球直徑對(duì)固定化四爿藻生長(zhǎng)的影響不顯著（P>005）。

2.2接種量對(duì)固定化四爿藻培養(yǎng)的影響

由表3可知，四爿藻接種量越大，其最終生長(zhǎng)量也越大，但生長(zhǎng)速率隨著接種量的增大而減小。使用SPSS 17.0軟件對(duì)其進(jìn)行單因子方差分析，結(jié)果表明，不同接種量對(duì)固定化四爿藻生長(zhǎng)的影響極顯著（P<0.01）。綜合考慮生長(zhǎng)量及生長(zhǎng)速率，選用藻細(xì)胞密度為1.82×104個(gè)/mL為固定化培養(yǎng)的初始密度。

2.3海藻酸鈉和氯化鈣濃度對(duì)四爿藻培養(yǎng)的影響

由表4可知，在接種量相同的情況下，當(dāng)海藻酸鈉濃度為10 g/L、氯化鈣濃度為20 g/L時(shí)，固定化四爿藻培養(yǎng)15 d后的藻細(xì)胞

生長(zhǎng)量最大，達(dá)1.26×107個(gè)/mL，生長(zhǎng)率也最高，達(dá)0168。

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因子方差分析，結(jié)果表明，海藻酸鈉和氯化鈣濃度對(duì)四爿藻生長(zhǎng)的影響極顯著（P<0.01）。

2.4水質(zhì)因子測(cè)定結(jié)果

2.4.1NH4+-N含量。

由圖1可知，固定化四爿藻對(duì)水體中的NH4+-N具有很強(qiáng)的去除力，從培養(yǎng)第2天開(kāi)始，加藻球試驗(yàn)組水體中的NH4+-N含量急劇降低，第3天NH4+-N去除率達(dá)98.87%，而對(duì)照組在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中NH4+-N變化較小。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明，固定化四爿藻對(duì)水體中NH4+-N濃度有極顯著影響（P<0.01）。

2.4.2

NO2--N含量。

從圖2可以看出，固定化四爿藻對(duì)水體中NO2--N具有很強(qiáng)的去除力，從試驗(yàn)第2天

開(kāi)始NO2--N含量急劇降低，第3天試驗(yàn)組中NO2--N的去除率達(dá)9833%，而對(duì)照組中的NO2--N含量變化不大。方差分析表明，固定化四爿藻對(duì)水體中NO2--N含量有極顯著影響（P<0.01）。

2.4.3PO43--P的測(cè)定結(jié)果。

從圖3可以看出，固定化四爿藻對(duì)水體中的PO43--P具有很強(qiáng)的去除力，試驗(yàn)第3天，試驗(yàn)組對(duì)水體中PO43--P的去除率達(dá)83.70%，第4天去除率達(dá)92%，對(duì)照組的PO43--P在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中波動(dòng)不大。

3討論

3.1固定化藻膠球的研制

固定化四爿藻膠球的制作工藝對(duì)四爿藻的生長(zhǎng)及污水處理密切相關(guān)。該試驗(yàn)結(jié)果表明，藻球直徑為 4 mm 時(shí)固定化四爿藻的生長(zhǎng)量最大，生長(zhǎng)率也最大。這與梁晶晶等[15]的研究結(jié)果相似，微綠球藻直徑為3.5 mm時(shí)，生長(zhǎng)率最大，藻球生長(zhǎng)量呈先升高后降低趨勢(shì)。經(jīng)方差分析可知，在該條件下，膠球直徑對(duì)固定化四爿藻生長(zhǎng)的影響不顯著（P>0.05）。鄭蓮等[16]研究表明，藻球直徑為4.5 mm時(shí)，生長(zhǎng)率最大，方差分析可知，3種藻球直徑（25、3.5和4.5 mm）對(duì)固定化波吉卵囊藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響不顯著（P>0.05）。

不同藻細(xì)胞包埋密度對(duì)固定化四爿藻生長(zhǎng)率影響顯著，隨著藻細(xì)胞包埋密度的增大，生長(zhǎng)率逐漸降低，包埋密度為 1.82×102個(gè)/mL時(shí)，生長(zhǎng)率為0.144，藻細(xì)胞生長(zhǎng)量?jī)H增加了4.82×103個(gè)/mL；包埋密度為1.82×104個(gè)/mL時(shí)，生長(zhǎng)率為0.130，藻細(xì)胞增長(zhǎng)量最大，達(dá)3.47×105個(gè)/mL；包埋密度增加為1.82×105個(gè)/mL時(shí)，生長(zhǎng)率下降為0.044，藻細(xì)胞增長(zhǎng)量為3.17×105個(gè)/mL?？梢?jiàn)，當(dāng)藻細(xì)胞密度增加為5個(gè)數(shù)量級(jí)后，生長(zhǎng)率急劇下降且藻細(xì)胞增長(zhǎng)量降至第2。這是由于隨著藻細(xì)胞密度的增大，一方面，藻球傳質(zhì)阻力增加，CO2 、O2 及營(yíng)養(yǎng)鹽在藻球中的擴(kuò)散速度降低；另一方面，藻細(xì)胞密度較大的藻球，藻細(xì)胞互相遮擋光線，藻球通透性降低而影響藻細(xì)胞生長(zhǎng)[15]。因而，選擇包埋密度為 1.82×104個(gè)/mL，而且這個(gè)藻細(xì)胞密度在一般培養(yǎng)時(shí)容易達(dá)到，不需要離心濃縮。經(jīng)多重比較，接種密度對(duì)固定化四爿藻生長(zhǎng)有顯著性差異（P<0.05）。因此，在試驗(yàn)和生產(chǎn)上應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的接種量。

在藻膠球直徑為4 mm，包埋藻細(xì)胞終密度為 1.82×104個(gè)/mL，海藻酸鈉濃度為10 g/L（海藻酸鈉∶藻液=4∶1），氯化鈣濃度為20 g/L的條件下，固定化四爿藻培養(yǎng)15 d后的藻細(xì)胞生長(zhǎng)量最大，達(dá)1.26×107個(gè)/mL，生長(zhǎng)率也最高。經(jīng)多重比較，表明不同濃度的海藻酸鈉、氯化鈣對(duì)四爿藻的生長(zhǎng)均有極顯著影響。

在預(yù)試驗(yàn)中，進(jìn)行了質(zhì)量濃度分別為10、20 g/L海藻酸鈉與藻液不同配比（1∶1、2∶1、3∶1、4∶1）試驗(yàn)，結(jié)果表明，10 g/L海藻酸鈉∶藻液=1∶1 時(shí)，不成球；10 g/L海藻酸鈉∶藻液=2∶1時(shí)，形狀不規(guī)則，破碎率10%；10 g/L海藻酸鈉∶藻液=4∶1時(shí)，藻球圓形，破碎率1.5%，藻球生長(zhǎng)良好；20 g/L海藻酸鈉∶藻液=1∶1 時(shí)，藻球圓形，破碎率1.0%，藻細(xì)胞生長(zhǎng)良好；20 g/L海藻酸鈉∶藻液=4∶1 時(shí)，破碎率為0，藻細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。 即在一定濃度范圍內(nèi)，保證膠藻成球的情況下，低濃度比高濃度的海藻酸鈉具有更好的生長(zhǎng)效率，因此選擇相對(duì)低濃度的海藻酸鈉。原因是較低濃度的海藻酸鈉形成膠球的強(qiáng)度較低，在形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)時(shí)對(duì)可以活動(dòng)的四爿藻的束縛能力不強(qiáng)，與水體的營(yíng)養(yǎng)鹽交換也更容易，有利于微藻細(xì)胞的分裂增殖。此外，還需要強(qiáng)調(diào)的是不同廠家生產(chǎn)的海藻酸鈉制作膠藻球所需的質(zhì)量濃度不同，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)篩選，該試驗(yàn)選用上海麥克林生化公司生產(chǎn)的海藻酸鈉。楊海波等[17] 研究表明，氯化鈣濃度越高，形成藻球的時(shí)間越短，藻球表面硬度越大，不利于藻生長(zhǎng)。該試驗(yàn)也證實(shí)了這一觀點(diǎn)。

3.2固定化藻膠球去除氮、磷的效果

在養(yǎng)殖廢水中引入固定化四爿藻，試驗(yàn)第3天，NH4+-N去除率達(dá)98.87%，NO2--N去除率達(dá) 98.33%，PO43--P去除率達(dá)83.7%。試驗(yàn)組養(yǎng)殖廢水中NH4+-N、NO2--N、PO43--P濃度極顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。這是由于試驗(yàn)組中的固定化四爿藻吸收了水體中的NH4+-N、NO2--N、PO43--P，用于生長(zhǎng)繁殖。這與前人的研究結(jié)果[18-20]一致，固定化微藻可有效降低水環(huán)境中的NH4+-N與NO2--N濃度，改善水質(zhì) 。因此，可以認(rèn)為固定化四爿藻在水產(chǎn)養(yǎng)殖、育苗等凈化水質(zhì)領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。

4結(jié)論

（1）固定化四爿藻培養(yǎng)的優(yōu)化條件為藻球直徑為4 mm、藻細(xì)胞包埋密度為1.82×104個(gè)/mL、海藻酸鈉質(zhì)量濃度為10 g/L 及氯化鈣濃度為20 g/L。

（2）固定化四爿藻去除養(yǎng)殖廢水中的NH4+-N、NO2--N和PO43--P的效果極顯著。

（3）采用海藻酸鈉固定化包埋技術(shù)不影響四爿藻的生理活性，固定化四爿藻可以應(yīng)用于凈化養(yǎng)殖水環(huán)境。

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