營(yíng)養(yǎng)因素影響蜜蜂級(jí)型分化的研究進(jìn)展

鄭素梅 羅娟 高玉人 萬萍

摘要從營(yíng)養(yǎng)元素方面綜述蜜蜂級(jí)型分化的研究進(jìn)展，介紹蜂王漿中10-HDA、Royalactin，蜂糧中相關(guān)MicroRNA對(duì)蜜蜂級(jí)型分化的影響，并展望今后蜜蜂級(jí)型分化分子機(jī)制的研究方向。

關(guān)鍵詞蜜蜂；級(jí)型分化；MicroRNA

中圖分類號(hào)S89文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）05-0025-03

AbstractThe research progress of caste differentiation of honey bee was reviewed from the aspects of nutritional factors，the effects of 10HDA and Royalactin in royal jelly and related MicroRNA in bee bread on caste differentiation of honey bee were introduced. The research direction of caste differentiation mechanism of honey bee was also prospected.

Key wordsHoney bee；Caste differentiation；MicroRNA

典型的蜂群是由蜂王、工蜂和雄蜂2種性別3種類型的蜜蜂群體組成，其中雌性蜜蜂分化出蜂王和工蜂2種級(jí)型[1]。蜂王的個(gè)體比較大，性器官發(fā)育完全，專門負(fù)責(zé)產(chǎn)卵生殖，繁衍后代；工蜂個(gè)體比較小，是生殖器發(fā)育不完全的雌蜂，專門負(fù)責(zé)建筑巢室、采集食料、哺育幼蟲、清理巢室以及調(diào)節(jié)巢濕等[2-3]。蜜蜂是一種經(jīng)濟(jì)昆蟲，同時(shí)作為社會(huì)生物學(xué)研究的模式生物，是一種高度真社會(huì)性昆蟲，生殖勞動(dòng)分工在社會(huì)性昆蟲當(dāng)中存在著極重要的進(jìn)化意義，而其基礎(chǔ)是級(jí)型分化。

級(jí)型分化是指在社會(huì)性昆蟲群體中，相同性別的個(gè)體在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理狀態(tài)和行為方式上存在顯著差異的現(xiàn)象。級(jí)型分化對(duì)于蜜蜂生物學(xué)的研究有著舉足輕重的意義，具體是指雌性蜜蜂幼蟲分化成生殖個(gè)體和非生殖個(gè)體——既可發(fā)育成為可育的蜂王個(gè)體，也可發(fā)育成為不可育的工蜂個(gè)體的現(xiàn)象。蜜蜂級(jí)型分化的關(guān)鍵時(shí)期是3～5日齡，1～3日齡所有的幼蟲喂養(yǎng)蜂王漿，大于4日齡雌性幼蟲喂養(yǎng)由花粉和蜂蜜調(diào)制的蜂糧，發(fā)育成為工蜂，只有蜂王房里的幼蟲始終喂養(yǎng)蜂王漿發(fā)育完全成為蜂王[4]。蜂王和工蜂兩者都是由受精卵發(fā)育而來的雌性蜜蜂，具有相同遺傳物質(zhì)的蜜蜂幼蟲在表型上存在巨大差異的關(guān)鍵環(huán)境決定因素在于差異性飼喂[5]。喂養(yǎng)蜂王漿的幼蟲發(fā)育成蜂王，喂養(yǎng)蜂糧的幼蟲發(fā)育成工蜂。

雌性蜜蜂級(jí)型分化現(xiàn)象是最典型的表觀遺傳現(xiàn)象之一。近年來，關(guān)于蜜蜂級(jí)型分化的研究已經(jīng)取得了諸多重要進(jìn)展[6-7]。長(zhǎng)期以來，就營(yíng)養(yǎng)對(duì)蜜蜂級(jí)型分化的研究主要集中在蜂王漿這一塊，但近期也有關(guān)于蜂糧對(duì)蜜蜂級(jí)型分化的影響研究。筆者綜合前人研究，主要從蜂王漿和蜂糧這兩個(gè)營(yíng)養(yǎng)因素方面，綜述營(yíng)養(yǎng)差異對(duì)雌性蜜蜂幼蟲級(jí)型分化產(chǎn)生的影響（圖1）。

1蜂王漿中相關(guān)物質(zhì)的促進(jìn)作用

蜂王漿的成分相對(duì)比較復(fù)雜，包括水、蛋白質(zhì)、脂肪酸、游離氨基酸、糖類、維生素和礦物質(zhì)等，它是蜜蜂巢中培育幼蟲的青年工蜂咽下腺和上顎腺分泌的乳漿狀物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)和糖類是蜂王漿的主要成分[8-9]，普遍認(rèn)為是蜂王漿刺激蜜蜂幼蟲分化成蜂王。

1.110-HDA是蜜蜂級(jí)型分化的主要活性因子

2011年，Spannhoff等[10]在《EMBO》雜志在線發(fā)表一項(xiàng)研究成果，研究表明蜜蜂幼蟲發(fā)育成為蜂王這一表觀遺傳現(xiàn)象可部分歸因于蜂王漿比蜂糧含有更高的組蛋白脫乙酰酶抑制劑（HDACi）活性。10-羥基-2-癸烯酸（10-hydroxy-2-decanoic acid，10-HDA，王漿酸）是蜂王漿的主要成分之一，具有組蛋白去乙酰化酶抑制劑（HDACi）活性。10-HDA 能夠抑制組蛋白去乙?；福℉DACs）的活性，從而使組蛋白乙?；皆黾?。組蛋白尾部氨基酸殘基的乙酰化能松弛染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，增加轉(zhuǎn)錄因子對(duì)靶基因的可訪問性[11]。因此，組蛋白乙?；降脑黾油ǔＥc基因表達(dá)的激活相聯(lián)系。HDACi能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期素依賴的蛋白激酶抑制因子p21，p21蛋白的主要功能是阻滯細(xì)胞的生長(zhǎng)[12-14]。在蜜蜂幼蟲的發(fā)育過程中，10-HDA可能通過增加p21基因的表達(dá)量，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，從而影響蜜蜂的生長(zhǎng)發(fā)育。

此外，DNA甲基化水平與蜜蜂級(jí)型分化息息相關(guān)，相關(guān)研究表明，DNMT3（DNA甲基轉(zhuǎn)移酶）表達(dá)沉默，能夠使蜜蜂幼蟲的發(fā)育方向從工蜂轉(zhuǎn)向蜂王[15-16]。應(yīng)用熒光定量 RT-PCR 技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)3日齡幼蟲DNMT3基因表達(dá)水平與組蛋白去乙?；?基因（HDAC4）的表達(dá)譜極為相似，都會(huì)隨著10-HDA 濃度的增加先顯著降低后又顯著升高，組蛋白去乙?；?（HDAC4）的活性對(duì)DNMT3基因的表達(dá)有重要的影響，繼而調(diào)控蜜蜂幼蟲的級(jí)型分化。

1.2Royalactin是蜜蜂級(jí)型分化的重要調(diào)控因子

蜂王漿的研究是蜂學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)，人們發(fā)現(xiàn)蜂王漿諸多生物學(xué)功能都是由主要王漿蛋白（major royal jelly proteins，MRJPs）產(chǎn)生的。MRJPs是一個(gè)比較大的蛋白家族，迄今為止已經(jīng)有9個(gè)家族成員被發(fā)現(xiàn)，分別命名為MRJP1、MRJP2、MRJP3、MRJP4、MRJP5s、MRJP6、MRJP7、MRJP8和MRJP9，含量最高的MRJP1（57 kDa蛋白）占水溶性蛋白的48%[17]。目前，有報(bào)道證明，蜂王漿中的Royalactin蛋白（也稱為MRJP1）是西方蜜蜂級(jí)型分化的關(guān)鍵因子，而蜂糧中Royalactin蛋白含量相對(duì)較低。

Kamakura[18]在新鮮的蜂王漿中發(fā)現(xiàn)了一種被稱為Royalactin（MRJP1）的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)能夠促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌，進(jìn)而調(diào)控一系列基因的表達(dá)，使幼蟲出現(xiàn)體型變大、卵巢發(fā)達(dá)等蜂王的特征，但是它不穩(wěn)定，在保存過程中會(huì)降解。Kamakura進(jìn)行了試驗(yàn)比對(duì)，分別喂養(yǎng)蜜蜂幼蟲新鮮的蜂王漿以及存放30 d的蜂王漿，研究發(fā)現(xiàn)只有喂養(yǎng)新鮮蜂王漿的蜜蜂幼蟲最后分化成為蜂王。然而，在貯存30 d的蜂王漿中加入Royalactin后，發(fā)現(xiàn)其能夠誘導(dǎo)蜜蜂幼蟲分化成為蜂王。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Royalactin可以通過脂肪體中的表皮生長(zhǎng)因子受體（Egfr）激活P70 S6激酶，這種激酶對(duì)幼蟲體型變大有重要作用，能夠增加細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶的活性，提高卵巢管發(fā)育必需的保幼激素水平，促進(jìn)蜜蜂幼蟲卵巢的發(fā)育，該激素在幼蟲發(fā)育期間的第五日齡決定幼蟲向著蜂王方向發(fā)育。Royalactin通過脂肪體中的Egfr信號(hào)通路激活MAPK，引起蛻皮激素水平的上升，從而縮短蜜蜂幼蟲發(fā)育的時(shí)間，保幼激素和蛻皮激素兩者共同協(xié)作并調(diào)控蜜蜂幼蟲的級(jí)型分化。

2蜂糧中相關(guān)MicoRNA的調(diào)控作用

MicroRNA（miRNA）的長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸，是一類內(nèi)生的非編碼單鏈RNA分子，在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，能通過抑制mRNA翻譯或者降解mRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用；在特定情況下，還有可能進(jìn)行翻譯激活從而正向調(diào)控基因的表達(dá)[19]。miRNA是表觀遺傳學(xué)主要研究方向之一。從理論上來說，蜜蜂作為一種高度社會(huì)化的昆蟲，其復(fù)雜的社會(huì)行為隨著基因表達(dá)的改變而受到調(diào)控，miRNA很有可能參與其中。

蜂糧是以花粉為原料，添加蜜蜂的分泌物并經(jīng)蜜蜂調(diào)制加工，經(jīng)微生物發(fā)酵而成。蜂王漿是青年工蜂食用花粉之后分泌的乳白色或者淡黃色的乳狀物，是其咽頭腺的分泌物，其中蛋白質(zhì)和糖類是蜂王漿的主要成分。研究蜂王漿、蜂糧、花粉以及蜂蜜中的成分，發(fā)現(xiàn)蜂王漿里99.9%的miRNA都是動(dòng)物源的。在蜂糧和花粉中發(fā)現(xiàn)了大量植物源的miRNA。Behura等[20]用熒光定量PCR的方法對(duì)20個(gè)miRNA在幼齡哺育蜂和老齡采集蜂大腦中的表達(dá)差異進(jìn)行了比較。發(fā)現(xiàn)其中miRNA-124、miRNA-14、miRNA-276、miRNA-13b、let-7和miRNA-13a在幼齡哺育蜂的大腦中高度表達(dá)；miRNA-12、miRNA-9、miRNA-219、miRNA-210、miRNA-263、miRNA-92和miRNA-283在老齡采集蜂的大腦中高度表達(dá)。該研究說明，蜜蜂基于日齡發(fā)生行為的改變中可能有miRNA的參與。有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)食物中的miRNA能夠被吸收，而且吸收以后能夠被送到相關(guān)的組織和器官中去，跨界調(diào)控動(dòng)物的基因，產(chǎn)生生物學(xué)作用[21-24]。

2.1相關(guān)植物miRNA對(duì)蜜蜂級(jí)型分化的影響

蜂糧和蜂王漿有一個(gè)最大的區(qū)別，即前者存在大量的植物miRNA。研究發(fā)現(xiàn)在蜂糧和花粉中可以利用qRT-PCR檢測(cè)到16種有代表性的植物miRNA（mir156a、mir157a、mir158a、mir160a、mir162a、mir166a、mir166g、Sly-miR167a、mir168a、mir172a、miR172c、mir390a、mir397a、mir403、miR824和mir845a），但在蜂王漿和蜂蜜中無法檢測(cè)到。

雌性蜜蜂幼蟲終身食用蜂王漿變成蜂王。然而，Zhu等[25]在蜂王漿中添加天然含量的人工合成的16種有代表性的植物miRNA，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)添加植物miRNA組別中的蜜蜂幼蟲的表型更加傾向于工蜂，發(fā)育緩慢，體型變小、不育。將食物中的植物miRNA剔除之后再喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)幼蟲趨向蜂王生長(zhǎng)。該研究說明蜂糧中存在的植物miRNA或許通過抑制蜜蜂幼蟲發(fā)育以及級(jí)型分化的信號(hào)通路，繼而抑制了蜜蜂幼蟲的卵巢、體重以及整體發(fā)育，從而分化成為工蜂。這一結(jié)果在果蠅身上也得到了驗(yàn)證。

2.2相關(guān)植物miRNA在蜜蜂級(jí)型分化信號(hào)通路中的調(diào)控作用

參與蜜蜂級(jí)型分化的信號(hào)通路有胰島素信號(hào)通路（IIS）、MAPK和S6K信號(hào)通路、蛋白激酶TOR信號(hào)通路等。TOR是真核生物中高度保守的一種大分子的Ser/Thr激酶，是免疫抑制劑雷帕霉素在體內(nèi)的靶物質(zhì)，能對(duì)營(yíng)養(yǎng)以及生長(zhǎng)因子等因素的變化做出應(yīng)答反應(yīng)，在細(xì)胞生長(zhǎng)增殖過程中發(fā)揮中樞作用[26]。已有研究證明蜜蜂TOR（Apis mellifera TOR，amTOR）在幼蟲級(jí)型分化中具有促進(jìn)作用：amTOR活性升高與蜜蜂幼蟲發(fā)育成蜂王息息相關(guān)，而降低amTOR活性將決定著蜜蜂幼蟲朝著工蜂的方向發(fā)展[27-28]。

2017年Zhu等[25]通過RNAhybrid和miRanda算法預(yù)測(cè)共有96個(gè)蜜蜂基因作為16種有代表性植物miRNA的靶基因。預(yù)測(cè)的96個(gè)基因中，大多數(shù)都只是一種植物miRNA的靶基因，而少數(shù)基因是2～3個(gè)miRNAs的共同靶基因。熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定試驗(yàn)表明miR162a特異性作用于amTOR并介導(dǎo)該基因的轉(zhuǎn)錄后抑制。

為了確定miR162a能單獨(dú)影響amTOR的表達(dá)，利用合成的miR162a或?qū)φ誖NA喂養(yǎng)蜜蜂幼蟲。與喂養(yǎng)對(duì)照RNA的蜜蜂幼蟲相比，喂養(yǎng)miR162a食料的蜜蜂miR162a攝入量顯著增加以及amTOR mRNA水平降低。同樣，在喂養(yǎng)花粉總RNA或miRNAs（含16種代表性miRNA）的蜜蜂中，amTOR mRNA水平被下調(diào)。與對(duì)任何測(cè)試形態(tài)特征無影響的對(duì)照RNA不同，在食物中加入miR162a的蜜蜂幼蟲羽化后體重顯著減輕，體型以及卵巢變小，更加趨近于工蜂的表型[25]。

3小結(jié)

蜜蜂是一種經(jīng)濟(jì)昆蟲，全球蜂群產(chǎn)生蜂產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)不可估量，蜜蜂授粉所引發(fā)的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)以及生態(tài)效應(yīng)更是一個(gè)龐大的數(shù)字。蜜蜂幼蟲級(jí)型分化一向是蜜蜂生物學(xué)的

研究熱點(diǎn)，對(duì)于雌性蜜蜂級(jí)型分化的研究，不僅可以有效地豐富蜜蜂的生物學(xué)理論，而且對(duì)于加快蜂群的繁殖，迅速培育強(qiáng)群打下非常堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為廣大養(yǎng)蜂群體以及養(yǎng)蜂業(yè)貢獻(xiàn)有效的力量。蜂王和工蜂都是由受精卵發(fā)育而來的，兩者具有相同的遺傳物質(zhì)，

但是在形態(tài)結(jié)構(gòu)、行為和生理特征上存在明顯的差異，諸多研究表明這種差異主要是幼蟲時(shí)期的營(yíng)養(yǎng)組分所造成的。研究蜜蜂幼蟲的主要食物來源——蜂王漿和蜂糧中各種活性組分的生物學(xué)功能對(duì)于解開工蜂和蜂王級(jí)型分化的謎團(tuán)是一個(gè)非常關(guān)鍵的因素。但是，到目前為止，對(duì)于蜜蜂幼蟲食物中對(duì)級(jí)型分化起作用的相關(guān)組分的識(shí)別尚未終結(jié)，依然存在著未知領(lǐng)域，仍然需要進(jìn)行深入研究。因此，蜜蜂對(duì)于表觀遺傳學(xué)的研究具有非常高的模型價(jià)值。對(duì)于影響蜜蜂級(jí)型分化的主要活性物質(zhì)，研究人員做了大量工作，目前已發(fā)現(xiàn)蜂王漿中存在大量的10-HAD和Royalactin蛋白，其在蜜蜂級(jí)型分化中起關(guān)鍵作用[29]。近來的研究發(fā)現(xiàn)蜂糧中植物源的miRNA含量同樣也對(duì)工蜂的分化起著非常重要的作用。隨著新生物技術(shù)的發(fā)展以及新領(lǐng)域的開拓，影響蜜蜂幼蟲級(jí)型分化的活性物質(zhì)和相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究逐漸豐富，可為哺乳動(dòng)物表觀遺傳學(xué)的研究提供更多理論基礎(chǔ)。

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