白熱斯丸對氫醌致C57BL/6小鼠白癜風模型的治療作用及機制研究

熱沙拉提·依孜則 馬麗 馬福昌 霍仕霞 斯拉甫·艾白 李治建

[摘要] 目的 探討白熱斯丸對皮膚外涂氫醌建立脫色C57BL/6小鼠白癜風模型的治療作用，為白熱斯丸的臨床前研究提供實驗支持。 方法 采用氫醌軟膏外涂皮膚復制C57BL/6小鼠白癜風模型：C57BL/6小鼠，SPF級，32只，雌雄各半，檢疫合格后用2.5%氫醌軟膏外涂皮膚連續(xù)造模20 d。造模動物皮膚均出現(xiàn)白斑，根據(jù)隨機數(shù)字表按皮膚白斑大小分組，分為空白對照組、模型對照組、白癜風膠囊組、白熱斯丸治療組，每組8只，雌雄各半?？瞻讓φ战M與模型對照組按20 mL/kg給予等體積溶媒，其他各組給予相應藥液，1次/d，連續(xù)30 d。隔天肉眼觀察毛發(fā)脫色及脫色面積并拍照。治療結(jié)束后摘眼球取血，分離血清采用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法測定酪氨酸酶含量。取皮膚進行蘇木精-伊紅（HE）染色法對含黑色素的毛囊進行計數(shù)。 結(jié)果 四組有黑色素的毛囊數(shù)所占比例、毛發(fā)脫色評分、血清酪氨酸酶含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）;與空白對照組比較，模型對照組有黑色素的毛囊數(shù)所占比例、血清酪氨酸酶含量降低，毛發(fā)脫色評分增大，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）;與空白對照組比較，白癜風膠囊組和白熱斯丸治療組有黑色素毛囊數(shù)所占比例減小，毛發(fā)脫色評分增大，差異均有高度有統(tǒng)計學意義（均P < 0.01），但兩組血清酪氨酸酶含量與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）;與模型對照組比較，白癜風膠囊組和白熱斯丸治療組有黑色素的毛囊數(shù)所占比例、血清酪氨酸酶含量增大，毛發(fā)脫色評分減小，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。白熱斯丸治療組有黑色素毛囊數(shù)所占比例、毛發(fā)脫色評分、血清酪氨酸酶含量與白癜風膠囊組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結(jié)論 白熱斯丸能夠促進酪氨酸酶含量增加，促進有活性的黑素細胞增生，從而促進黑素的生成，毛發(fā)脫色評分也明顯降低，對C57BL/6小鼠白癜風模型有較好的治療作用，并可能與白癜風膠囊有同樣的治療作用。

[關(guān)鍵詞] 白癜風;C57BL/6小鼠模型;氫醌;維吾爾醫(yī)

[中圖分類號] R29? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）05（a）-0018-04

Study on the therapeutic effect and mechanism of Bairesi Pills on vitiligo model induced by hydroquinone in C57BL/6 mice

Reshalati·Yizize1? ?MA Li2? ?MA Fuchang2? ?HUO Shixia2? ?Silafu·Aibai2? ?LI Zhijian2

1.School of Traditional Uighur Medical， Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi? ?830011， China; 2.Department of Toxicology Laboratory， Xinjiang Institute of Traditional Uyghur Medicine， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi? ?830049， China

[Abstract] Objective To investigate the therapeutic effect of Bairesi Pills on the skin coated with hydroquinone to establish a decolorized model of vitiligo in C57BL/6 mice， so as to provide experimental support for the preclinical study of Bairesi Pill. Methods The model of vitiligo in C57BL/6 mice was established by applying hydroquinone ointment on the skin： C57BL/6 mice， SPF level， 32 mice， male and female half. After passing quarantine， 2.5% hydroquinone ointment was applied on the skin for 20 days. All the model animals had vitiligo on their skin. According to the random number table of the size of vitiligo， the model animals were divided into the blank control group， the model control group， the Vitiligo Capsules group， and the Bairesi Pills treatment group， with 8 patients in each group， half male and half female. The blank control group and the model control group were given equal volume solvent according to 20 mL/kg， and the other groups were given corresponding solution once a day for 30 consecutive days. On the next day， the decolorization and decolorization area of the hair were observed and photographed. After the treatment， the eyeballs were collected and the blood was collected. The serum was isolated and the tyrosinase content was determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The hair follicles containing melanin were counted by hematoxylin-eosin （HE） staining in skin. Results There were statistically significant differences in the proportion of hair follicles， hair decolorization score and serum tyrosinase content in the four groups （all P < 0.05）. Compared with the blank control group， the proportion of melanin hair follicles and the serum tyrosinase content in the model control group decreased， and the hair decolorization score increased， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with the blank control group， the proportion of melanin hair follicles in the Vitiligo Capsules group and the Bairesi Pills treatment group decreased， and the hair decoloration score increased， the differences were highly statistically significant （all P < 0.01）， but there was no statistically significant difference in the serum tyrosinase content between the two groups compared with the blank control group （P > 0.05）. Compared with the model control group， the proportion of melanin hair follicle number， the serum tyrosinase content and the hair decolorization score in the Vitiligo Capsules group and the Bairesi Pills treatment group increased， and the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. The proportion of melanin hair follicles， hair decolorization score and serum tyrosinase content in the Bairesi Pills treatment group were not statistically significant compared with the Vitiligo Capsules group （P > 0.05）. Conclusion Bairesi Pills can promote the increase of tyrosinase content， promote the proliferation of active melanocytes， so as to promote the generation of melanin， hair decolorization score is also significantly reduced， on the C57BL/6 mice model of vitiligo has a good therapeutic effect， and may have the same therapeutic effect as Vitiligo Capsules.

[Key words] Vitiligo; C57BL/6 mice model; Hydroquinone; Uygur medicine

白癜風是一種常見的色素脫失性皮膚病，以皮損內(nèi)黑素細胞數(shù)目減少甚至消失或黑素細胞功能障礙，皮膚、黏膜或毛發(fā)的色素脫失為特征，在全球范圍內(nèi)患病率為1%～2%[1-2]。男女患者和所有種族/民族的發(fā)病率沒有差異[3]，以青少年最為多見[4]，50%左右白癜風在20歲前發(fā)病[5]。白癜風的發(fā)病率目前呈逐年上升趨勢[6]，其發(fā)病機制至今未明，各種療法的無效率可高達50%[7]。有文獻報道白癜風的發(fā)病與自身免疫、遺傳因素、黑色素細胞自身破壞、神經(jīng)化學因子、心理因素、外傷、微量元素、環(huán)境因素等有關(guān)[8]。雖然白癜風基本不影響患者的身體健康和生理活動，但會影響患者的生活質(zhì)量[9]。白熱斯丸由驅(qū)蟲斑鳩菊、盒果藤、干姜等幾種生藥組成。具有熟化和清除異常黏液質(zhì)、溫膚著色的功效。本試驗通過建立C57BL/6小鼠白癜風模型，觀察白熱斯丸對黑素細胞增生、黑色素的生成和酪氨酸酶增加的影響，探討其治療白癜風的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試藥物? 白熱斯丸[新疆制藥廠（試制），批號：180217];白癜風膠囊[天津宏仁堂藥業(yè)有限公司（市售），批號：G06011]。

1.1.2 動物? C57BL/6小鼠，重量18～22 g，雌雄各半，購于新疆醫(yī)科大學動物中心，鼠全價顆粒飼料，飼養(yǎng)于新疆維吾爾醫(yī)藥研究所。

1.1.3 儀器? TDL-5-A離心機（上海安亭科學儀器廠）、MULTISKAN FC酶標儀（賽默飛世爾上海儀器有限公司）、DM4000光學顯微鏡（德國萊卡）、RM2245切片機（德國萊卡）。

1.1.4 試劑? 小鼠酪氨酸酶酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（ELISA）（江萊生物，批號：JL20441）。

1.2 實驗方法

購入C57BL/6小鼠后，飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，動物適應環(huán)境3 d，第4天，松香/蠟混合物脫去各小鼠背部毛2 cm×2 cm，24 h后開始造模，造模周期為50 d，C57BL/6小鼠32只，依次編號后根據(jù)隨機數(shù)字表按皮膚白斑大小分為空白對照組、模型對照組、白癜風膠囊組和白熱斯丸治療組，各組雌雄各半共8只?？瞻讓φ战M受試區(qū)涂抹滅菌蒸餾水，劑量為0.5 mL/d，bid;模型對照組、白癜風膠囊組白熱斯丸組受試區(qū)涂抹2.5%氫醌軟膏，劑量為100 mg/（kg·d），bid;從第21天開始，白熱斯丸治療祖和白癜風膠囊組灌胃給藥30 d，隔1天進行皮膚情況拍照。實驗期間密切觀察小鼠皮膚顏色變化。

1.3 觀察指標

1.3.1 肉眼觀察模型對照組皮膚變化? 毛發(fā)脫色評估[10]，每天觀察毛發(fā)脫色情況，將脫色部位分為涂藥區(qū)域和非涂藥區(qū)域，每個區(qū)域總分為5分，每只小鼠共10分。小鼠毛發(fā)脫色評分標準：0分為毛發(fā)無脫色;毛發(fā)脫色面積0≤1分≤10%;毛發(fā)脫色面積11%≤2分≤25%;毛發(fā)脫色面積26%≤3分≤50%;毛發(fā)脫色面積51%≤4分≤75%;毛發(fā)脫色面積76%≤5分≤100%。

1.3.2 小鼠血清酪氨酸酶含量? 用酪氨酸酶標準溶液繪制酪氨酸酶標準溶液回歸曲線，獲得回歸方程，對各組給藥結(jié)束后，小鼠摘眼球取血，取小鼠血清，測定酪氨酸酶含量。

1.3.3 小鼠皮膚含黑色素毛囊計數(shù)? C57BL/6小鼠黑色素分布以毛囊分布為主，單位面積有色毛囊的計數(shù)可以直觀的反應皮膚黑色素分布的水平[11]。取1 cm×1 cm的皮膚組織蘇木精-伊紅（HE）染色后，進行皮膚組織學觀察、毛囊計數(shù)，用光鏡觀察50個毛囊，計算其中有黑色素的毛囊數(shù)所占比例。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組比較采用ANOVA分析（F檢驗），兩兩比較采用LSD法，計數(shù)資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 空白對照組小鼠脫色情況

空白對照組小鼠涂抹滅菌蒸餾水50 d后，未出現(xiàn)脫色。

2.2 模型對照組脫色情況

模型對照組用藥部位在實驗第12天開始出現(xiàn)脫色毛發(fā)點（圖1A）;第21天全部小鼠的抹藥部位出現(xiàn)脫色（圖1B），且脫色范圍逐漸擴大;軀干沒有用藥的部位第29天開始出現(xiàn)毛發(fā)脫色情況（圖1C）。

2.3 白熱斯丸對實驗性白癜風模型血清酪氨酸酶含量的影響

四組有黑色素的毛囊數(shù)所占比例、毛發(fā)脫色評分、血清酪氨酸酶含量比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P < 0.05）;與空白對照組比較，模型對照組有黑色素的毛囊數(shù)所占比例、血清酪氨酸酶含量降低，毛發(fā)脫色評分增大，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）;與空白對照組比較，白癜風膠囊組和白熱斯丸治療組有黑色素毛囊數(shù)所占比例減小，毛發(fā)脫色評分增大，差異有高度有統(tǒng)計學意義（P < 0.01），但兩組血清酪氨酸酶含量與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）;與模型對照組比較，白癜風膠囊組和白熱斯丸治療組有黑色素的毛囊數(shù)所占比例、血清酪氨酸酶含量增大，毛發(fā)脫色評分減小，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。白熱斯丸治療組有黑色素毛囊數(shù)所占比例、毛發(fā)脫色評分、血清酪氨酸酶含量與白癜風膠囊組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1。

表1? ?白熱斯丸對白癜風模型有黑色素的毛囊數(shù)、皮膚評分、血清酪氨酸酶含量的影響（x±s）

注：與空白對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01;與模型對照組比較，#P < 0.05，##P < 0.01

2.4 皮膚病理組織學和黑色素分布情況

空白對照組（見圖2a）皮膚表皮棘層及基底層細胞均含黑色素顆粒。模型對照組（見圖2d）皮膚表皮棘層明顯增厚，角質(zhì)層明顯增生，基底層細胞及棘層細胞幾乎見不到黑色素，毛囊內(nèi)黑色素明顯減少。白熱斯丸治療組（見圖2c）和白癜風膠囊組（見圖2d）基底層細胞及棘層細胞中黑色素增加明顯，毛囊內(nèi)黑色素明顯增多。

3 討論

白癜風維醫(yī)學被稱為“白熱斯”“阿拉艾提”“皮賽”[12]。阿維森納為古代著名維吾爾醫(yī)，在11世紀時曾撰寫《醫(yī)典》，書云：白癜風是因膿性黏液質(zhì)過度旺盛，阻礙力的功能，削弱排除力，而患者體內(nèi)所產(chǎn)生代謝物質(zhì)無法排出體外所致[13]。維醫(yī)將白癜風分為甜味、咸味、酸味、澀味、淡味、凝固樣黏液質(zhì)型白癜風等6型[14]。異常黏液質(zhì)是引起白癜風的主要原因，異常黏液質(zhì)在性質(zhì)上包含過度濕和過度寒[15]，體內(nèi)異常黏液質(zhì)的過盛導致異常黏液質(zhì)沉著在皮膚底部，阻礙皮膚的正常代謝，使營養(yǎng)成分不能完全輸送到肌膚部位，使黑色素細胞不能正常生成發(fā)育，從而造成皮膚脫色，出現(xiàn)白癜風灶。

維醫(yī)治療白癜風藥物種類繁多，有一批療效確切、副作用小的藥物主要是通過熟化及清除異常黏液質(zhì)，改善血液循環(huán)及支配器官功能，提高自然力，自然恢復已被紊亂的免疫功能，實現(xiàn)身體免疫功能的平衡，從而治療白癜風[16]。本實驗使用的C57BL/6小鼠是白癜風研究中使用最為廣泛的實驗動物之一，適合于研究毛囊黑素細胞及白癜風復色相關(guān)的研究[17-19]，本實驗應用白熱斯丸對白癜風小鼠模型連續(xù)治療30 d，結(jié)果顯示，白熱斯丸治療組脫毛區(qū)皮膚白斑較模型對照組減輕，光鏡下發(fā)現(xiàn)治療組基底層細胞及棘層細胞中黑色素增加明顯，毛囊內(nèi)黑色素明顯增多。酪氨酸酶是黑色素生物合成過程中的關(guān)鍵酶[20]，酪氨酸酶是一種銅結(jié)合金屬酶，在黑素生成過程中，催化酪氨酸生成多巴胺和多巴醌等一系列過程，進而促進黑素細胞產(chǎn)生黑色素[21]。黑素細胞的減少或消失是白癜風的基本病理變化[22]。本實驗結(jié)果也提示白熱斯丸能明顯增強酪氨酸酶的活性（P < 0.05），可使白癜風模型小鼠血清酪氨酸酶含量升高，說明白熱斯丸能改善白癜風病變，對白癜風有一定的治療作用并促進皮膚黑色素的生成。本實驗結(jié)果表明，與空白對照組比較，模型對照組、白癜風膠囊組和白熱斯丸治療組有黑色素的毛囊數(shù)所占比例減小，毛發(fā)脫色評分增大，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）;與模型對照組比較，白癜風膠囊組和白熱斯丸治療組有黑色素的毛囊數(shù)所占比例增大，毛發(fā)脫色評分減小，差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。白熱斯丸治療組有黑色素毛囊數(shù)所占比例、毛發(fā)脫色評分與白癜風膠囊組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。這說明白熱斯丸治療雖然對白癜風有較好的治療作用，但不能痊愈。

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（收稿日期：2019-02-23? 本文編輯：顧家毓）