登革病毒復(fù)制復(fù)合體的研究進(jìn)展

羅娟　鄭素梅　高玉人

[摘 要]登革病毒的復(fù)制與宿主細(xì)胞膜的重建緊密相關(guān)。病毒和細(xì)胞因子產(chǎn)生獨(dú)特的類似細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)，被稱為病毒復(fù)制復(fù)合體（viral replication complex），這些病毒誘導(dǎo)的隔間促進(jìn)了高效基因組復(fù)制，在病毒復(fù)制周期中得以使不同步驟受到精確的時(shí)空調(diào)控，并且保護(hù)病毒RNA不受宿主細(xì)胞質(zhì)環(huán)境影響。綜合運(yùn)用超微結(jié)構(gòu)解析和功能研究大大增加了我們對(duì)病毒復(fù)制復(fù)合體構(gòu)建和生物起源的理解。本文將介紹登革熱病毒復(fù)制復(fù)合體的形態(tài)和形成，闡述其在生物發(fā)生中所取得的進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞]登革病毒；正鏈RNA；復(fù)制復(fù)合體；內(nèi)陷囊泡；膜重建；脂質(zhì)

[中圖分類號(hào)]R373.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

登革病毒（Dengue virus；DENV）屬于黃病毒科黃病毒屬，包括4個(gè)亞型：DENV1-4。它是一種蚊媒病毒，含單股正鏈RNA病毒，有包膜。每年大約有一億人感染DENV，感染者癥狀從輕微的感冒到危及生命的登革出血熱（dengue hemorrhagic fever）和登革休克綜合征（dengue shock syndrome）。登革熱廣泛流行于東南亞、非洲、美洲、地中海中部等地區(qū)，近50年來(lái)，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。迄今為止，既無(wú)DENV預(yù)防疫苗問(wèn)市，也沒(méi)有針對(duì)性的抗病毒治療方案應(yīng)用于臨床。研究病毒基因組復(fù)制的分子機(jī)制有助于病毒疫苗以及具有特異性的抗病毒藥物的研發(fā)。

病毒依賴于宿主細(xì)胞代謝來(lái)擴(kuò)增病毒基因組和組裝傳染性子代病毒。正鏈RNA病毒的復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或病毒誘導(dǎo)的類似細(xì)胞器的膜結(jié)構(gòu)表面，這種膜結(jié)構(gòu)可以被稱為病毒復(fù)制復(fù)合體，可以有效地促進(jìn)病毒復(fù)制。首先，病毒復(fù)制復(fù)合體實(shí)現(xiàn)了RNA翻譯、復(fù)制和將病毒基因組組裝成病毒粒子，旦它們之間互不干擾；第二，病毒復(fù)制復(fù)合體可以使病毒復(fù)制酶復(fù)合物的組成成分和復(fù)制需要的代謝物在一個(gè)物理空間中保持高濃度；第三，為病毒RNA提供獨(dú)立于細(xì)胞質(zhì)的環(huán)境是病毒復(fù)制復(fù)合體的另一個(gè)進(jìn)化保守特征。在本綜述中，我們重點(diǎn)介紹病毒復(fù)制復(fù)合體的形態(tài)，詳細(xì)闡述病毒的膜重建，并討論這些病毒破壞細(xì)胞的膜活性蛋白和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)通路在病毒復(fù)制復(fù)合體生物形成中的最新發(fā)現(xiàn)。

1 復(fù)制復(fù)合體的結(jié)構(gòu)

由于登革病毒的體積較小，約17-25nm，病毒學(xué)的研究一直與電子顯微鏡的發(fā)展密切相關(guān)。DENV誘導(dǎo)的復(fù)制復(fù)合體是內(nèi)陷囊泡或球囊類型，是從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生出來(lái)的。利用電子斷層攝影技術(shù)對(duì)受DENV感染的人類肝癌細(xì)胞進(jìn)行掃描，研究人員發(fā)現(xiàn)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的是直徑大約90nm的單膜囊泡而非結(jié)構(gòu)化復(fù)雜膜。這些囊泡通過(guò)大約10nm的孔樣通道與細(xì)胞質(zhì)相連接。內(nèi)陷囊泡中包含病毒復(fù)制酶和雙鏈RNA（double strand RNA；dsRNA），而結(jié)構(gòu)化復(fù)雜膜不包含dsRNA，但它們富含病毒蛋白，可能在病毒蛋白的合成或儲(chǔ)存中發(fā)揮作用。Junjhon等在DENV感染的蚊子細(xì)胞中也觀察到內(nèi)陷囊泡，卻沒(méi)有觀察到結(jié)構(gòu)化復(fù)雜膜，這表明結(jié)構(gòu)化復(fù)雜膜在登革復(fù)制周期中可能是一種對(duì)人細(xì)胞特異的結(jié)構(gòu)。值得注意的是，DENV誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)陷囊泡與西尼羅河病毒（WNV）和蜱傳腦炎病毒（TBEV）誘導(dǎo)的復(fù)制復(fù)合體相類似，這表明黃病毒復(fù)制復(fù)合體在生物起源和結(jié)構(gòu)進(jìn)化上具有保守性。

2 復(fù)制周期的時(shí)空控制

不同生物合成步驟促進(jìn)病毒復(fù)制周期的時(shí)空協(xié)調(diào)。病毒由受體介導(dǎo)進(jìn)入易感靶細(xì)胞，由低PH介導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜融合，核衣殼釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，脫殼后病毒RNA基因組轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，作為信使RNA合成病毒蛋白。病毒 RNA5端的帽子結(jié)構(gòu)介導(dǎo)帽子依賴性RNA翻譯。根據(jù)病毒多聚蛋白前體的共翻譯和翻譯后加工，膜結(jié)合的病毒因子和細(xì)胞因子以協(xié)調(diào)一致的方式誘導(dǎo)膜重排，形成病毒復(fù)制復(fù)合體。病毒的正鏈RNA被復(fù)制成負(fù)鏈RNA，負(fù)鏈RNA作為模板產(chǎn)生大量新的正鏈RNA，新的正鏈RNA又可以合成多聚蛋白或作為新負(fù)鏈RNA復(fù)制的模板或被組裝成病毒粒子。但是RNA翻譯與復(fù)制之間的轉(zhuǎn)換調(diào)節(jié)機(jī)制目前還不能確定。一種可能性是將核糖體排除在病毒RNA復(fù)制的位置，另一種可能性是病毒RNA基因組環(huán)化，使翻譯核糖體與病毒復(fù)制酶競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。RNA-RNA相互作用或蛋白質(zhì)與病毒基因組末端的相互作用可以遠(yuǎn)程介導(dǎo)上述復(fù)制與翻譯的拮抗作用。

3 復(fù)制復(fù)合體的病毒決定因素

病毒通過(guò)對(duì)膜脂質(zhì)的局部改造或蛋白質(zhì)的非對(duì)稱相互作用來(lái)構(gòu)建利于其復(fù)制的膜系統(tǒng)。非結(jié)構(gòu)蛋白NS4A和NS4B在DENV 誘導(dǎo)的膜重建中起著重要作用。兩者都有復(fù)雜的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)并包含中心螺旋，局部增加膜表面積，有利于誘導(dǎo)囊泡產(chǎn)生。這一過(guò)程可能是由NS4A的寡聚作用或NS4A與NS4B的相互作用維持的。但是，僅有NS4A或NS4B表達(dá)誘導(dǎo)產(chǎn)生的膜結(jié)構(gòu)與DENV感染細(xì)胞所誘導(dǎo)的膜結(jié)構(gòu)不同，說(shuō)明還有額外的病毒蛋白參與了復(fù)制復(fù)合體的生成。研究發(fā)現(xiàn)NS1形成二聚體與膜結(jié)合并誘導(dǎo)膜重建，而且可能與NS4A-NS4B復(fù)合體相互作用。具有膜滲透活性的整合膜蛋白NS2A也可能參與了復(fù)制復(fù)合體的誘導(dǎo)，但具體機(jī)制還有待研究。除了蛋白質(zhì)內(nèi)在的膜活性，病毒還選擇性地影響脂質(zhì)和膜穩(wěn)態(tài)。這些過(guò)程包括招募細(xì)胞膜形成蛋白，刺激脂質(zhì)體生成，并重組細(xì)胞脂質(zhì)傳輸系統(tǒng)，具體調(diào)節(jié)病毒復(fù)制復(fù)合體膜成分。

4 膜活性蛋白對(duì)復(fù)制復(fù)合體形成的作用

關(guān)于病毒如何聯(lián)合選擇宿主細(xì)胞蛋白用于復(fù)制復(fù)合體形成的具體機(jī)制目前仍不明確。例如：中間纖維的結(jié)構(gòu)組成部分波形蛋白與DENV非結(jié)構(gòu)蛋白 NS4A相互作用。由NS4A介導(dǎo)的波形蛋白的招募依賴于病毒RNA的有效擴(kuò)增。肌動(dòng)蛋白絲的聚合在DENV誘導(dǎo)的膜重建中起著重要的作用（與內(nèi)吞作用密切相關(guān)）。但是，膜重建中波形蛋白的作用與肌動(dòng)蛋白絲的作用是否類似還有待研究。

波形蛋白對(duì)復(fù)制復(fù)合體的形成有重要作用，但是缺乏其他相關(guān)細(xì)胞因子的信息，目前我們只能從誘導(dǎo)同一類型的復(fù)制復(fù)合體的其他正鏈RNA病毒中推斷其作用。例如雀麥草花葉病毒（BMV），它也在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔的內(nèi)陷囊泡中復(fù)制。這些囊泡的生成需要網(wǎng)狀蛋白。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白包括類似發(fā)夾結(jié)構(gòu)的跨膜區(qū)，與高曲率的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)小管的產(chǎn)生和穩(wěn)定有關(guān)。BMV復(fù)制酶蛋白1a（replicase protein 1a）將網(wǎng)狀蛋白招募到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的內(nèi)陷部位，通過(guò)部分中和整體負(fù)膜曲率或穩(wěn)定正膜曲率促進(jìn)球形體積的擴(kuò)增。網(wǎng)狀蛋白或其他細(xì)胞膜形成蛋白是否也參與了病毒復(fù)制復(fù)合體的生物形成，這個(gè)問(wèn)題仍有待研究。

5 復(fù)制復(fù)合體形成對(duì)脂質(zhì)生成的影響

除了重塑現(xiàn)有的細(xì)胞內(nèi)膜，病毒復(fù)制復(fù)合體的生成意味著細(xì)胞內(nèi)膜表面的凈增加，因此需要重新合成膜脂質(zhì)。DENV感染細(xì)胞的高通量脂質(zhì)分析顯示，病毒誘導(dǎo)的脂質(zhì)成分發(fā)生的明顯變化包括主要脂質(zhì)結(jié)構(gòu)和信號(hào)脂類特異性的上調(diào)或下調(diào)。DENV不依賴由甾醇控制的調(diào)控元素結(jié)合蛋白（sterol regulatory element- binding protein；SREBP）介導(dǎo)的脂質(zhì)生成，而是利用細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的脂質(zhì)。DENV感染會(huì)誘發(fā)自噬介導(dǎo)的脂滴分解，從而釋放游離脂肪酸。游離脂肪酸可用作建立病毒復(fù)制復(fù)合體的材料，或作為線粒體β氧化的能量來(lái)源。另外，DENV也會(huì)破壞脂肪酸合成酶（FAS）來(lái)刺激復(fù)制復(fù)合體的產(chǎn)生。FAS是一個(gè)大的含有多種酶活性的同質(zhì)二聚體蛋白，用于脂質(zhì)合成和細(xì)胞膜形成。非結(jié)構(gòu)蛋白NS3與FAS相互作用，在復(fù)制復(fù)合體建立時(shí)招募FAS到病毒復(fù)制酶復(fù)合體上。NS3刺激FAS活性合成脂質(zhì)，新合成的脂質(zhì)與病毒RNA共同作用，表明在復(fù)制復(fù)合體形成過(guò)程中FAS直接參與膜的擴(kuò)張。此外，西尼羅河病毒（WNV）也依賴于FAS，說(shuō)明這種保守的功能在黃病毒復(fù)制復(fù)合體的生物形成中發(fā)揮了作用。

6 結(jié)論與展望

DENV基因組的復(fù)制與病毒復(fù)制復(fù)合體的形成有關(guān)，復(fù)制復(fù)合體的形成對(duì)病毒復(fù)制周期進(jìn)行時(shí)空調(diào)控，確保RNA高效擴(kuò)增以及必需的細(xì)胞因子保持一定的局部濃度，并保護(hù)病毒RNA不受細(xì)胞質(zhì)環(huán)境影響。DENV誘導(dǎo)內(nèi)陷囊泡或球囊類型的復(fù)制復(fù)合體，病毒內(nèi)在膜蛋白的固有特性（膜活性區(qū)，不對(duì)稱的形狀和低聚性），有助于復(fù)制復(fù)合體的形成。DENV利用自噬從脂質(zhì)中調(diào)集脂滴，同時(shí)利用脂肪酸合成酶來(lái)增加病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)膜表面積。

盡管先進(jìn)的電子顯微鏡成像技術(shù)能在形態(tài)學(xué)細(xì)節(jié)上描述病毒復(fù)制復(fù)合體，但是它們的生物形成和共同選擇的細(xì)胞因子的復(fù)雜相互作用還尚待明確。由于技術(shù)上的局限，復(fù)制復(fù)合體形成的機(jī)制并不確定，特別是關(guān)于它們生物形成早期階段的信息是稀缺的。這些限制可以通過(guò)相關(guān)的光學(xué)和電子顯微鏡來(lái)克服，它們對(duì)細(xì)胞的分析具有極高的精確度。此外，病毒蛋白和RNA標(biāo)記策略的技術(shù)應(yīng)用于時(shí)間分辨成像，將為轉(zhuǎn)運(yùn)加工過(guò)程和病毒復(fù)制周期中不同的時(shí)空調(diào)控提供更詳細(xì)的信息。病毒蛋白-固有膜相互作用的分子機(jī)制的描述也很少。在原生的膜環(huán)境中測(cè)定它們的三維結(jié)構(gòu)，使用固態(tài)核磁共振波譜與膜模型體外研究相結(jié)合的策略將提供更深層次的解析。此外，病毒復(fù)制復(fù)合體的高通量蛋白質(zhì)組學(xué)和脂質(zhì)譜分析，將揭示它們的分子組成，從而擴(kuò)大我們對(duì)與病毒復(fù)制復(fù)合體的生物發(fā)生和功能有關(guān)的宿主因素和途徑的認(rèn)識(shí)。這些方法的綜合應(yīng)用將揭示病毒誘導(dǎo)的膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步揭示細(xì)胞膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)的原理，為抗病毒治療提供新的途徑。

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