植物抗寒性基因研究綜述

王慶杰 王立

[摘 要]綜述了在低溫脅迫下，植物不飽和酶基因，脯氨酸和甜菜堿的調(diào)節(jié)及其基因表達(dá)，Ca2+及鈣依賴的蛋白激酶對(duì)植物抗寒性反應(yīng)中的調(diào)節(jié)，抗氧化酶，植物冷誘導(dǎo)基因，植物抗凍蛋白基因工程的研究進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞]植物；抗寒基因；表達(dá)

[中圖分類號(hào)]Q945.78 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

在低溫脅迫下，植株的細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)受到傷害，而且會(huì)引發(fā)物質(zhì)代謝紊亂，甚至引起死亡，在農(nóng)業(yè)以及林業(yè)生產(chǎn)中造成重大的損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界每年因植物凍害造成的損失達(dá)2000億美元左右。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，導(dǎo)入外源基因已經(jīng)成為提高植物抗逆性的主要手段。因此，對(duì)植物抗逆性基因的研究，無論在理論上還是實(shí)際生產(chǎn)中，都有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。本文綜述了近年來抗寒性基因工程的研究進(jìn)展。

1 植物不飽和脂肪酸酶及基因

Levitt，Paha等以及Orvat指出，冷害首先發(fā)生在細(xì)胞膜和與細(xì)胞膜相關(guān)的過程。在冷脅迫下，植物的膜系統(tǒng)會(huì)發(fā)生相變，膜脂從液晶相變?yōu)槟z相，使膜發(fā)生收縮，使鑲嵌于膜上的膜蛋白（酶）被固定，酶系統(tǒng)遭受到破壞，膜上出現(xiàn)孔道或龜裂，細(xì)胞膜的主動(dòng)運(yùn)輸和選擇透過的特性喪失，膜透性增大，因此使膜內(nèi)可溶性物質(zhì)、電解質(zhì)大量向膜外滲透，破壞了細(xì)胞內(nèi)外的離子平衡。膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性直接影響光合和呼吸作用的活性。因此，低溫首先引起膜系統(tǒng)的透性和活性的變化，從而使光合作用減弱，體內(nèi)的保護(hù)系統(tǒng)受到破壞，呼吸速率大起大落，同時(shí)細(xì)胞間冰晶對(duì)細(xì)胞膜和細(xì)胞壁產(chǎn)生機(jī)械損傷，水分平衡受到破壞，最終導(dǎo)致植物死亡。

影響植物膜質(zhì)脂肪酸飽和性的酶主要有兩類，一類是膜質(zhì)脫飽和酶，另一類是脂酰轉(zhuǎn)移酶。

在低溫下，膜質(zhì)脫飽和酶可以被誘導(dǎo)表達(dá)，從而提高植物在低溫下的不飽和度，增加膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。在已研究的膜脂脫飽和酶基因中fad4、fad5、fad6、fad7、fad8、desC和des9有控制葉綠體中脂肪酸的脫飽和作用；fad2和fad3控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的脂肪酸脫飽和作用。desC基因編碼△9酯酰脫飽和酶，催化已經(jīng)?；礁视虲-1位置的硬脂酸在9號(hào)碳的位置形成第1個(gè)雙鍵。轉(zhuǎn)化大腸桿菌和煙草試驗(yàn)表明，desC基因轉(zhuǎn)化可提高轉(zhuǎn)化體的不飽和度，增強(qiáng)抗寒性。fad3、fad8、fad7編碼的蛋白為w-3脂肪酸脫飽和酶，他們催化亞油酸脫飽和作用，形成a-亞油酸，轉(zhuǎn)化w-3脂肪酸脫飽和酶可以提高轉(zhuǎn)化植株三不飽和脂肪酸含量，提高了植物的抗寒性。

2 脯氨酸和甜菜堿的調(diào)節(jié)作用及其基因表達(dá)

大量的研究揭示，在低溫脅迫下，植物細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)水分虧缺和滲透脅迫，作為滲透調(diào)節(jié)劑和滲透保護(hù)劑的脯氨酸、甜菜堿及糖醇等相容性溶質(zhì)的積累，是植物響應(yīng)低溫脅迫的一個(gè)重要機(jī)制。其中，脯氨酸和甜菜堿是分布最普遍和效應(yīng)最廣泛的兩種。

幾乎所有的高等植物，在低溫脅迫下，都會(huì)發(fā)生脯氨酸的大量積累。只是不同的種類和品種間有差異，有的增加幾倍，有的增加幾十倍、上百倍不等。研究表明，隨著脯氨酸的含量的增加，植物的抗逆性也增加?？傊?xì)胞內(nèi)脯氨酸積累與植物體抗逆性的增強(qiáng)的密切關(guān)系，已為許許多多的研究結(jié)果所確實(shí)。

研究表明，抗凍性極強(qiáng)的高山雪蓮在人工控制的2℃ 低溫鍛煉過程中，脯氨酸合成酶基因的表達(dá)水平也提高，導(dǎo)致脯氨酸的積累增加，幼苗的抗凍性也增加。番茄培養(yǎng)細(xì)胞在水分缺虧條件下迅速積累脯氨酸水平比對(duì)照正常條件下高300倍。

甜菜堿也是一種極好的相容性溶質(zhì)。它有很多種類型，甘氨酸甜菜堿（glycine betaine，GB）是其中的一種代表型。甜菜堿的積累可顯著提高植物的抗寒性，如將COD基因轉(zhuǎn)入擬南芥，使其中的甜菜堿高積累達(dá)到1.2umol/gFW以上，可提高擬南芥的抗寒性。將BADH基因轉(zhuǎn)入煙草、小麥和草莓中，實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)基因植物的BADH增高，其抗寒性和抗鹽性均增強(qiáng)。

有研究指出，當(dāng)大麥幼苗水分虧缺或鹽脅迫時(shí)，甜菜堿和脯氨酸同時(shí)以相似的速度在葉片積累，但當(dāng)脅迫解除后，二者的降解速度卻十分不同，葉片和根中脯氨酸含量迅速下降，而甜菜堿的含量保持基本穩(wěn)定。這說明，脯氨酸的積累是植物對(duì)脅迫的暫時(shí)性反應(yīng)，而甜菜堿的積累則是有一定時(shí)間的持久性。甜菜堿代謝緩慢的特點(diǎn)，表明代謝主要是由其合成酶所調(diào)控，而脯氨酸的迅速代謝則是受其合成酶和降解酶兩個(gè)方面調(diào)節(jié)，在脅迫時(shí)，降解酶被抑制；當(dāng)脅迫解除，降解酶立即活化，因而含量迅速減少。

3 植物冷誘導(dǎo)基因及轉(zhuǎn)錄因子CBF

植物冷誘導(dǎo)基因是種誘發(fā)基因，只有在一定的條件下，才能被誘發(fā)表達(dá)（主要為低溫和短日照）。有些基因?qū)Ｒ恍缘厥艿蜏卣T導(dǎo)表達(dá)，可稱之低溫專一誘導(dǎo)基因； 而有些基因不僅受低溫誘導(dǎo)，還能被ABA、短日照、水分脅迫等誘導(dǎo)，這樣的誘導(dǎo)基因又可稱為冷調(diào)節(jié)基因。

在最近的幾十年中，已經(jīng)有很多經(jīng)過低溫脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)的抗寒性基因從植物體內(nèi)分離得到。如擬南芥中，冷誘導(dǎo)基因-Cor基因，又稱為L(zhǎng)ti或rd或Kin基因，研究較多的是Cor15、Cor6.6和Cor78；油菜的BN28和BN15，這兩個(gè)冷誘導(dǎo)基因分別與擬南芥的Cor6.6和Cor15同源，苜蓿的cas18和cas15基因，菠菜的cap基因，馬鈴薯的PA13基因，小麥的Cor39、WCS120和WCS200基因等。

在擬南芥對(duì)低溫和干旱脅迫反應(yīng)的啟動(dòng)子分析中，Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki（1994）證實(shí)，冷調(diào)節(jié)原件是一種保守序列9bpTACCGACAT組成，其核心序列為5bpCCGAC，也稱C-repeat/TRE，這個(gè)調(diào)節(jié)原件可對(duì)低溫響應(yīng)。該序列在其他抗寒基因的序列中也發(fā)現(xiàn)了，包括擬南芥的COR15a，油菜的BNII5，小麥的WCSI20。要研究調(diào)控的分子機(jī)理必須分離出編碼C-repeat結(jié)合蛋白的cDNA—CBF1。CBF1可結(jié)合到CRT/DRE的DNA調(diào)控基序上，它的分子質(zhì)量為24kDa，含有一個(gè)AP2區(qū)域，其中有一個(gè)DNA結(jié)合區(qū)段。就目前已知的CBF家族中包括有CBF1，CBF2，CBF3，CBF4。由于CBF1-3基因除了具有抗寒作用外，還有抗旱性。所以它們又被分別稱為DREB1b，DREB1c，DREB1a。

CBF/DREB1基因能在冷脅迫下迅速且瞬間表達(dá)，它的產(chǎn)物可以激活它下游的各種脅迫反應(yīng)的靶基因表達(dá)。所有的Cor基因的啟動(dòng)子都帶有CRT/RDE調(diào)節(jié)元件，可與轉(zhuǎn)錄活化因子CBF-結(jié)合，可刺激Cor基因的表達(dá)。Jaglo-Ottosen等（1998）培育出能夠超表達(dá)CBF1的擬南芥，使得整套的Cor基因（Cor6，Cor15a，Cor47，Cor78，KN1，ERD10等）在沒有低溫誘導(dǎo)下也能表達(dá)。他們通過細(xì)胞膜電解質(zhì)滲透實(shí)驗(yàn)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)CBF1的植株抗寒性比只表達(dá)Cor15a植株的抗寒性高3.3℃；CBF1的超表達(dá)還能提高植株的冰凍存活率，而只表達(dá)Cor15a植株則不能。有研究表明，Cor15a基因表達(dá)產(chǎn)物15kDa多肽在輸入葉綠體基質(zhì)片層中后，被加工成9.8kDa的成熟多肽。在轉(zhuǎn)基因的擬南芥植株中，Cor15a的表達(dá)，可以增強(qiáng)葉綠體的抗寒性，從-4～-8℃增加到-6～-10℃。

4 Ca2+及鈣依賴的蛋白激酶對(duì)植物抗寒性反應(yīng)中的調(diào)節(jié)

大量的研究表明，Ca2+是低溫下參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的第二信使，參與信號(hào)的傳遞。在低溫脅迫下，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平增加。Ca2+可和CaM結(jié)合形成Ca2+-CaM復(fù)合物，使CaM活化，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)各種依賴Ca2+的生理生化過程。Ca2+-CaM可直接作用于效應(yīng)系統(tǒng)，如激活質(zhì)膜和液泡膜上的Ca2+-ATPase，使增加的Ca2+撤退。另一方面，Ca2+-CaM可磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)將信號(hào)傳遞各下游脅迫響應(yīng)基因，調(diào)控這些基因的表達(dá)和產(chǎn)物的活化，使植株的抗寒性增加。

在由低溫引起的Ca2+流入和抗凍基因的表達(dá)中，植物鈣依賴的蛋白激酶（caIciurn dependent protein kinases，cDPKs）的轉(zhuǎn)錄水平增高，cDPKs的激酶活性被進(jìn)一步激活。

Ray等的研究發(fā)現(xiàn)，在低溫、干旱、鹽脅迫條件下，水稻中31個(gè)CDPKs基因中有6個(gè)基因受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)量上升，1個(gè)基因受脅迫刺激表達(dá)量下降。Wan等對(duì)11個(gè)水稻CDPKs基因在干旱、低溫、高鹽和稻瘟病菌浸染等脅迫和激發(fā)子處理?xiàng)l件下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析表明，每個(gè)基因至少受2種脅迫誘導(dǎo)而產(chǎn)生2倍以上水平的表達(dá)變化。在正常環(huán)境條件下，水稻OsCDPKs7基因轉(zhuǎn)錄水平很低，在10d齡的水稻小苗中檢測(cè)不到mRNA的積累，但當(dāng)經(jīng)過鹽脅迫或低溫處理8～24h后，OsCDPK7基因mRNA表達(dá)量大量增加。OsCDPK13基因受低溫誘導(dǎo)表達(dá)上升，并且在耐低溫品種中的表達(dá)量高于在低溫敏感品種中的表達(dá)量。OsCDPK7基因表達(dá)量越高轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)脅迫的耐性就越強(qiáng)。同時(shí)，OsCDPK7基因的超表達(dá)增強(qiáng)了salT、rabl6A等脅迫響應(yīng)基因在鹽脅迫條件下的誘導(dǎo)。這表明OsCDK7基因可能就是調(diào)控salT、rabl6A 等下游脅迫響應(yīng)基因來參與水稻對(duì)鹽脅迫的耐性反應(yīng)。但在低溫脅迫下不能誘導(dǎo)這些基因的表達(dá)。這些結(jié)果表明OsCDPK7基因同時(shí)參與了水稻低溫和鹽脅迫反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，但水稻對(duì)低溫脅迫與鹽脅迫的響應(yīng)是兩條不同的信號(hào)途徑。

在低溫下，Ca2+的增加還可促進(jìn)脯氨酸的積累，這一現(xiàn)象已在Amarathus和番茄幼苗及培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中證實(shí)。Ca2+還可調(diào)節(jié)冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)?？梢?，Ca2+ 在植物細(xì)胞對(duì)低溫反應(yīng)中起著一個(gè)中心的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)作用，對(duì)植物的抗寒性有著極其重要的作用。

5 抗氧化酶基因

活性氧（reactive oxyen species，ROS）是生物體有氧代謝產(chǎn)生的一類活性含氧化合物總稱，包括有超氧陰離子（O2-），過氧化氫（H2O2），羥自由基（.OH），單線態(tài)氧（1O2）等。高濃度的活性氧幾乎能與所有細(xì)胞成分發(fā)生反應(yīng)：破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，嘌呤氧化，并引起脂質(zhì)的過氧化，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞。

許多研究表明，外界環(huán)境的脅迫，包括低溫、干旱、鹽堿等非生物脅迫會(huì)導(dǎo)致ROS的發(fā)生和抗氧化系統(tǒng)間的動(dòng)態(tài)平衡的破環(huán)。在這些逆境中，如寒凍脅迫過程中，自由基將會(huì)積累，從而造成植物細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，從而引發(fā)一系列的植物細(xì)胞的損傷。植物的抗氧化系統(tǒng)能夠穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)膜透性。超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和抗壞血酸過氧化物酶（APX）等，這些物質(zhì)協(xié)同作用以去除植物體內(nèi)的活性氧自由基，尤其以SOD最為重要，它是植物體內(nèi)清除活性氧的關(guān)鍵抗氧化酶。

Gupta等將外源Cu/Zn-SOD基因?qū)霟煵葜?，轉(zhuǎn)化株的葉綠體中SOD 超表達(dá)，SOD酶的活性升高，同時(shí)清除APX 活性也升高，從而增加了煙草抵抗低溫引起發(fā)光抑制的能力。

6 植物抗凍性蛋白（植物AFP）

AFP是一種適應(yīng)低溫的特異蛋白質(zhì)，它能阻止體液內(nèi)冰核的形成與生長(zhǎng)，維持體液的非冰凍狀態(tài)。了解其特征和抗凍生理機(jī)制對(duì)農(nóng)作物抗凍品種選育有重要意義。

AFP是一種低溫誘導(dǎo)蛋白，胡蘿卜的AFP基因在非冷馴化狀態(tài)下不表達(dá)，而在冷馴化狀態(tài)下表達(dá)水平迅速呈特異性地提高。轉(zhuǎn)基因植物的AFPs通常只在低溫（4℃）誘導(dǎo)下才能檢測(cè)到其表達(dá)。更值得一提的是，AFPs有親水性和熱穩(wěn)定性，這也與冷誘導(dǎo)蛋白相似。

Griffith等第一次明確提出獲得了植物內(nèi)源AFPs，他們從經(jīng)過低溫鍛煉的可以忍受胞外結(jié)冰的冬黑麥葉片質(zhì)外體中得到并部分純化了抗凍蛋白。同年，美國圣母大學(xué)的Duman實(shí)驗(yàn)室在多種植物中發(fā)現(xiàn)了具有熱滯效應(yīng)的蛋白質(zhì)。1994年我國學(xué)者費(fèi)云標(biāo)等從常綠抗凍植物沙冬青（Ammop ip tanthus monglicus） 葉片中分離得到了抗凍蛋白的蛋白質(zhì)。

AFP不僅存在于被子植物中，且裸子植物、蕨類植物及苔蘚植物中均發(fā)現(xiàn)有抗凍活性的特異蛋白質(zhì)。另外低等植物包括真菌和細(xì)菌中也存在AFP。已研究的絕大多數(shù)植物材料中AFP活性大大低于魚類和昆蟲，所研究的植物雖多達(dá)幾十種，但真正被分離純化出來的AFPs尚不多，據(jù)報(bào)道冬季常綠喬木北海道黃楊能忍耐-23.9℃低溫，若能從其中提取出抗寒基因并轉(zhuǎn)入其他植物，無疑將極大地提高轉(zhuǎn)基因植株抗寒性，因?yàn)橹参飪?nèi)源AFPs基因更適合在植物體內(nèi)表達(dá)。因此如何從植物中分離出更多的、活性更高的AFP，并通過遺傳轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)人抗寒性弱或不抗寒植物中進(jìn)而獲得抗寒性強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株，將是今后植物抗寒性基因工程研究的主要內(nèi)容之一。

若能夠很好地將植物抗寒性基因的研究應(yīng)用于寒冷地區(qū)林業(yè)植物以及農(nóng)業(yè)植物的栽培當(dāng)中，我們將會(huì)在林業(yè)栽培以及農(nóng)作物種植方面取得極大的進(jìn)展。

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