家畜中抗菌素耐藥性：抗生素的進(jìn)展與替代（續(xù)1）

張江

上期回顧：本篇文章上期主要闡述了最近動(dòng)物飼料行業(yè)使用抗生素的進(jìn)展情況和抗生素替代品的概況，其中包括：使用CRTSPR/Cas基因編輯系統(tǒng)逆轉(zhuǎn)抗生素耐藥性并用作抗菌劑、增強(qiáng)抗茵效力的抗生素綴合物、以噬菌體作為抗菌劑、設(shè)計(jì)用于控制體內(nèi)微生物疾病的抗菌肽以及使用化學(xué)合成的病毒樣納米粒子（納米抗生素）殺死致病茵。

中圖分類(lèi)號(hào)：S831.5? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C? ?文章編號(hào)：1001-0769（2018）07-009604

7 宿主防御/先天免疫

免疫系統(tǒng)由先天（非特異性）和適應(yīng)性（特異性）應(yīng)答組成。先天免疫是結(jié)構(gòu)性存在的，并在感染后迅速動(dòng)員起來(lái)。先天免疫也被稱(chēng)為非特異性免疫，因?yàn)闊o(wú)論初始感染如何，保護(hù)性應(yīng)答都是相同的。相反，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)響應(yīng)較慢，并會(huì)產(chǎn)生免疫記憶。如果人體的第一道防線(xiàn)一一先天性免疫系統(tǒng)一一在消滅病原體方面不成功，大約4 d～～7 d后特定的適應(yīng)性免疫應(yīng)答便啟動(dòng)。這意味著適應(yīng)性防御需要更長(zhǎng)的時(shí)間，但它能更準(zhǔn)確地針對(duì)病原體。增強(qiáng)動(dòng)物免疫系統(tǒng)可減少抗生素的使用。

8 疫苗是解決抗生素耐性的重要藥物

人類(lèi)和動(dòng)物接種疫苗是預(yù)防感染、降低抗生素需要的一種有效方法。更好地利用現(xiàn)有疫苗及開(kāi)發(fā)新疫苗是解決抗生素耐藥性、減少可預(yù)防疾病及動(dòng)物死亡的重要途徑。亞單位疫苗、脫氧核糖核苷酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）疫苗和核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）疫苗是完整致病菌疫苗有吸引力的替代品。佐劑是疫苗非常重要的成分，因?yàn)樗鼈兛蓽p少產(chǎn)生免疫效果所需疫苗的劑量和份數(shù)。有三種含有toll樣受體激動(dòng)劑佐劑或其聚合物：胞嘧啶（poly-c）或CpG寡脫氧核苷酸、宿主防御肽和聚磷腈。合成的胞嘧啶和CpG寡脫氧核苷酸是眾所周知可增強(qiáng)免疫應(yīng)答的有效佐劑。宿主防御肽是一種天然肽的衍生物，它是一種帶有陽(yáng)離子（帶正電）兩親性的肽，具有免疫調(diào)節(jié)功能。聚磷腈是一種合成的水溶性生物可降解聚合物，具有刺激免疫的功能，可與病毒和細(xì)菌抗原形成非共價(jià)復(fù)合物，以提高其免疫原性和穩(wěn)定性。三個(gè)佐劑在小鼠、大鼠、豬、綿羊、雞和考拉中穩(wěn)定高效，與多種抗原一起使用時(shí)，可有效誘導(dǎo)長(zhǎng)效的體液免疫和細(xì)胞免疫。研究人員應(yīng)用不同的方法將富含CpG的寡核苷酸與糖聚合物連接形成可溶性納米顆粒佐劑，這種可溶性納米顆粒佐劑與重組炭疽抗原進(jìn)行單次免疫可誘導(dǎo)猴子產(chǎn)生高滴度的抗體，完全保護(hù)它們免受致死性炭疽攻擊。這種可溶性納米顆粒佐劑應(yīng)該是有一種有應(yīng)用前景的佐劑，因?yàn)樗梢酝ㄟ^(guò)單次免疫刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體。

采用一種完全不同的疫苗接種方法可將能表達(dá)特異性抗原DNA序列的質(zhì)粒直接導(dǎo)入動(dòng)物組織中，從而獲得免疫應(yīng)答。研究人員證明陽(yáng)離子脂質(zhì)體制備的乙型肝炎病毒DNA疫苗在豬中產(chǎn)生的免疫應(yīng)答與一種蛋白疫苗安在時(shí)（EngerixB）產(chǎn)生的免疫應(yīng)答量級(jí)相當(dāng)。有研究人員開(kāi)發(fā)出帶電（陽(yáng)離子）的DNA復(fù)合微針疫苗。他們發(fā)現(xiàn)這種疫苗的免疫反應(yīng)比傳統(tǒng)給藥高出3.5倍。這種新型微針疫苗具有持久的免疫力，生產(chǎn)成本低，在動(dòng)物中易于施用，具有較長(zhǎng)的保存期，并且可以適用于控制幾乎任何種類(lèi)動(dòng)物的疾病。最新的方法是使用mRNA來(lái)制備疫苗。雖然DNA疫苗和mRNA疫苗有許多相似之處，但兩種疫苗之間的主要差異在于寡核苷酸釋放的目標(biāo)位置。DNA療法必須到達(dá)細(xì)胞核，而RNA療法的目標(biāo)是胞液。mRNA疫苗可誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答，生成高濃度抗體。脂質(zhì)納米顆粒作為將mRNA運(yùn)送至細(xì)胞的載體可以很容易地合成，保護(hù)mRNA不被降解，并且可以與佐劑共同釋放。與DNA疫苗一樣，美國(guó)食品及藥物管理局（Food and DrugAdministration，F(xiàn)DA）未將RNA疫苗視為基因療法。疫苗技術(shù)的諸多進(jìn)步為在動(dòng)物中產(chǎn)生持續(xù)的高滴度抗體提供了手段，且在控制或預(yù)防動(dòng)物疾病中相對(duì)便宜且高效。在RNA疫苗和DNA疫苗廣泛用于家畜和家禽之前，必須對(duì)RNA疫苗和DNA疫苗的安全性和有效性進(jìn)行更多的研究。

9 應(yīng)用雞卵黃抗體和植物免疫球蛋白控制家畜和人類(lèi)腸道病原體

口服抗體免疫療法（被動(dòng)免疫）是控制動(dòng)物腸道疾病中的一種非常有吸引力和有效的方法，因?yàn)樗鼈兙哂懈咛禺愋?、有效性和快速作用的特點(diǎn)。目前已經(jīng)成功使用了哺乳動(dòng)物血清和初乳制備的口服抗體及單克隆抗體，但它們的成本過(guò)高。

與此相反， 被稱(chēng)為免疫球蛋白Y（Immunoglobulin Y，IgY）的雞卵黃免疫球蛋白預(yù)防和控制動(dòng)物疾病的效果相當(dāng)引人注目，因?yàn)榕c哺乳動(dòng)物免疫球蛋白G相比，卵黃抗體具有成本效益高、使用方便和抗體產(chǎn)量高等諸多優(yōu)點(diǎn)（圖3）。口服IgY已被用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物、家禽和水產(chǎn)動(dòng)物中的多種細(xì)菌性和病毒性疾病。研究人員對(duì)口服IgY控制家畜腹瀉的能力進(jìn)行了薈萃分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IgY能夠降低所有試驗(yàn)動(dòng)物（包括豬、小鼠、家禽和犢牛）的腹瀉發(fā)病率。他們建議進(jìn)行更多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步確認(rèn)單獨(dú)使用IgY或IgY與其他替代產(chǎn)品組合使用的功效。

盡管己證明相對(duì)少量的IgY在控制動(dòng)物腸道病原體感染方面非常有效，但需要更多的研究以提高抗體治療的功效。這包括獲取中和不同程度感染所需的特異性抗體量（抗體滴度）以及治療的持續(xù)時(shí)間和頻度等信息。除了優(yōu)化IgY治療方案外，選擇免疫程序提高蛋雞卵黃抗體的產(chǎn)量也很重要，因?yàn)檫@直接關(guān)系到運(yùn)營(yíng)利潤(rùn)和生產(chǎn)成本。幾種新的免疫方案可用于蛋雞，使蛋黃中產(chǎn)生高濃度的抗體。為了提高免疫反應(yīng)的效果，有必要使用佐劑，因?yàn)樗纱碳ぎa(chǎn)生更快、更強(qiáng)和更持久的免疫力。前文討論的兩種新型疫苗平臺(tái)可用于產(chǎn)蛋母雞，以高水平和持續(xù)地生成IgY。另一種可能的方法是使用DNA疫苗或RNA疫苗，因?yàn)樗鼈兛梢粤畠r(jià)方式生產(chǎn)抗體。

一種非常有吸引力的替代抗體的來(lái)源是通過(guò)植物生產(chǎn)抗體。植物瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的出現(xiàn)使得在實(shí)驗(yàn)室和工業(yè)化規(guī)?？焖俸桶踩a(chǎn)抗體成為可能。植物生產(chǎn)抗體的主要特點(diǎn)是安全、快速、低成本和便利性，新手能夠快速掌握該技術(shù)并充分利用其優(yōu)勢(shì)。使用植物進(jìn)行產(chǎn)品開(kāi)發(fā)為同時(shí)表達(dá)多種不同基因提供了動(dòng)力和靈活性，從而可以構(gòu)建新型生物納米材料。植物可用于生產(chǎn)基于抗體的超分子結(jié)構(gòu)，并將在多方面得到應(yīng)用。例如，可以設(shè)計(jì)耐受胃腸道pH和消化酶影響的抗體，從而減少抗體的用量。預(yù)計(jì)未來(lái)的抗體產(chǎn)品將可充分利用植物系統(tǒng)的獨(dú)特功能。幾家全球性公司擁有生產(chǎn)生物納米藥物的能力。

10 采用抗體包被技術(shù)防止免疫球蛋白在胃腸道中失活

口服被動(dòng)免疫可能是抗體最有價(jià)值的應(yīng)用之一。但是抗體必須在胃腸道環(huán)境中存活并到達(dá)發(fā)揮其生物學(xué)特性的目標(biāo)區(qū)域才能產(chǎn)生效果。與任何蛋白質(zhì)一樣，抗體對(duì)蛋白水解酶敏感。胃部的消化酶和低pH可降低或破壞IgY的活性。相反，IgY對(duì)pH 6～7的小腸和大腸中的蛋白酶作用相當(dāng)穩(wěn)定。針對(duì)牛IgG通過(guò)人胃腸道的研究表明，只有4%～19%抗體活性能保留下來(lái)。研究人員評(píng)估了在納米復(fù)合材料基質(zhì)中的IgY對(duì)感染產(chǎn)腸毒素大腸桿菌仔豬的體內(nèi)保護(hù)效力。受保護(hù)的IgY完全阻止了腸毒素性大腸桿菌誘導(dǎo)的腹瀉，而服用未受保護(hù)的IgY的仔豬腹瀉發(fā)生率為100%。這些研究表明，包被IgY可大大提高其有效性。

總之，盡管大部分的IgY在胃中失活，但是對(duì)控制動(dòng)物、家禽和水產(chǎn)動(dòng)物的多種腸道病原體感染非常有效。包被的IgY在不降解的情況下被完整地釋放到大腸，并在大腸中產(chǎn)生生物活性。需要研究確定治療疾病所需的IgY最佳劑量，以提高抗體的功效和成本效益。此外應(yīng)使用新的免疫方法來(lái)提高蛋黃中IgY的濃度。通過(guò)植物大量低成本地生產(chǎn)抗體是較有前景的新方法。

11 通過(guò)口服低濃度脂質(zhì)體包被型鋅來(lái)預(yù)防和治療動(dòng)物的腸道疾病

仔豬日糧中添加1500 mg/kg～3 000 mg/kg的氧化鋅已廣泛用于抑制細(xì)菌對(duì)腸道的黏附和侵入，防止增重下降、吸收性絨毛萎縮和腹瀉。但是日糧中高濃度的氧化鋅會(huì)造成環(huán)境污染。歐洲允許豬日糧的氧化鋅最高含量為150 mg/kg，遠(yuǎn)低于產(chǎn)生有益作用所需的濃度。最新的研究證明，日糧中添加100 mg/kg的脂質(zhì)體包被型氧化鋅不僅可產(chǎn)生與添加2 500 mg/kg未包被氧化鋅同樣的效果，減輕斷奶仔豬腹瀉和生長(zhǎng)遲緩，而且獲得與抗生素治療類(lèi)似的效果。這些結(jié)果表明，脂質(zhì)體包被型鋅和很可能其他幾種改進(jìn)的鋅產(chǎn)品可以在低濃度下有效減輕產(chǎn)腸毒素大腸桿菌對(duì)豬的影響。已經(jīng)證明這些改進(jìn)的鋅化合物可以用于控制包括人類(lèi)在內(nèi)大多數(shù)動(dòng)物的其他腸道疾病。

12 作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑的攝生素

最近，動(dòng)物飼料工業(yè)已經(jīng)使用攝生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑來(lái)替代抗生素。攝生素主要用于保持動(dòng)物腸道的生態(tài)平衡，改善動(dòng)物的健康狀況和生產(chǎn)性能。研究人員詳細(xì)評(píng)估了益生菌、益生元、有機(jī)酸、外源酶、精油和草藥等非抗生素類(lèi)生長(zhǎng)促進(jìn)劑（攝生素）的益處。作者認(rèn)為，益生菌和有機(jī)酸是最佳的抗生素促長(zhǎng)劑替代品。此外利用新的基因方法，有可能會(huì)增強(qiáng)或開(kāi)發(fā)出具有獨(dú)特口服免疫治療效果的新型益生菌。

13 動(dòng)物對(duì)疾病的遺傳抗性

動(dòng)物的基因型和環(huán)境之間的相互作用涉及遺傳和健康。研究人員對(duì)多種動(dòng)物疾病如肉毒桿菌感染、口蹄疫和非洲豬瘟進(jìn)行的品種易感性研究發(fā)現(xiàn)不同品種間存在差異。也有證據(jù)表明，不同品種的豬對(duì)非洲豬瘟、萎縮性鼻炎、偽狂犬、豬圓環(huán)病毒相關(guān)病、沙門(mén)氏菌病及產(chǎn)腸毒素大腸桿菌F4和F18感染等疾病的易感性存在差異。

表達(dá)F4（以前稱(chēng)為K88）菌毛的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌是新生仔豬和仔豬斷奶前腹瀉的主要原因，可造成養(yǎng)豬業(yè)非常大的經(jīng)濟(jì)損失。研究人員描述了MUC13基因與豬腸道致病性大腸桿菌F4ac的易感性/抗性的因果關(guān)系。他們發(fā)現(xiàn)，MUC13A等位基因與不同豬群中F4ac非黏附表型完全相關(guān)，所有易感動(dòng)物至少攜帶一個(gè)MUC13B等位基因。總體而言，他們的研究結(jié)果具有重要的實(shí)用意義，并將對(duì)豬的育種計(jì)劃產(chǎn)生直接影響，因?yàn)樗鼈兛梢钥焖傧赘械任换?，因此將大大有利于?dòng)物福利和養(yǎng)豬業(yè)。

對(duì)其他動(dòng)物疾病進(jìn)行的類(lèi)似研究將極大地提高人們對(duì)疾病遺傳抗性動(dòng)物的選擇。這些發(fā)展不僅將減少養(yǎng)殖業(yè)對(duì)抗生素的需求，而且還將克服與特定疾病相關(guān)的抗生素耐藥性問(wèn)題。

14 結(jié)論

最近在生物技術(shù)和納米結(jié)構(gòu)材料應(yīng)用方面取得了顯著的進(jìn)展，新的方案不僅針對(duì)耐藥性細(xì)菌，而且可有效治療和預(yù)防各類(lèi)牲畜和人類(lèi)的微生物感染。這些進(jìn)展包括：（1） CRIPSR/Cas基因編輯系統(tǒng)靶向消除細(xì)菌中抗生素抗性基因并直接殺滅微生物;（2）生產(chǎn)可在體內(nèi)殺死細(xì)菌的噬菌體;（3）使用能夠有效殺滅微生物的基因工程肽和化學(xué)合成的病毒樣模擬物;（4）使用改良的新型免疫技術(shù)解決抗生素耐藥性問(wèn)題;（5）使用卵黃抗體和植物免疫球蛋白以及包被型氧化鋅來(lái)快速有效地治療人類(lèi)和動(dòng)物的腸道疾病。預(yù)計(jì)上述手段將開(kāi)發(fā)出安全、高效的新型抗菌產(chǎn)品.這些抗菌產(chǎn)品具有不同的作用機(jī)制，其中大部分不會(huì)引發(fā)細(xì)菌耐藥性。這些進(jìn)展將明顯有助于解決抗生素耐藥性問(wèn)題。

（續(xù)完）