養(yǎng)殖過程中的生物安全

莊志偉 薛墨庸 韓薇 秦玉昌

摘 要：實驗室檢測，一是涉及食品安全問題（如病毒、細(xì)菌和寄生蟲）的檢測診斷與分析以及重金屬的檢測等，二是血清學(xué)檢測，主要是指抗體檢測，在保證合理采樣與正確運輸?shù)幕A(chǔ)上，采用規(guī)范的實驗操作來減少相關(guān)的誤差，確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性與及時性。針對臨床疾病的復(fù)雜程度，正確的實驗室檢測是提供合理的診斷與防控措施的依據(jù)之一，也是生物安全體系不可或缺的重要部分。

關(guān)鍵詞：養(yǎng)殖；生物安全；檢測；防控

中圖分類號：S851 文獻標(biāo)志碼：C 文章編號：1001-0769（2018）09-0055-06

隨著中國改革開放程度和人們對動物疾病對人類健康危害的認(rèn)識程度逐步提高，規(guī)?；B(yǎng)殖場的硬件設(shè)施和養(yǎng)殖者的管理水平也在不斷提高。但是，由于眾多的原因，疫情反而越來越復(fù)雜，臨床疾病主要是全身性感染疾病、呼吸道疾病和消化道疾病，這主要是因為毒株的變異增加了疫病的復(fù)雜性，尤其病原的隱性感染和種畜禽的隱性帶毒導(dǎo)致了病原的不明傳播。另外，已得到控制的疫病再次暴發(fā)，使防控越來越難，疾病已經(jīng)成為制約養(yǎng)殖生產(chǎn)的重要因素之一。養(yǎng)殖從業(yè)者已經(jīng)清晰地意識到僅靠生產(chǎn)數(shù)據(jù)、臨床癥狀、病理變化及飼養(yǎng)管理調(diào)整來進行疾病診斷較為困難，因此需要借助實驗室檢測結(jié)果和各種疾病的流行病學(xué)來共同確診，實驗室檢測已經(jīng)成為生物安全體系不可或缺的重要部分，也是獸醫(yī)的“第三只”眼睛[1]。5S管理由于能在短期內(nèi)改善生產(chǎn)環(huán)境并提高生產(chǎn)效率已被廣泛應(yīng)用，“實驗室檢測”實時反映公眾的關(guān)注點，也使公眾的注意力可視化，有能力驗證實驗做得規(guī)范且結(jié)果準(zhǔn)確才是實驗室能力的綜合體現(xiàn)。

1 檢測功能

可據(jù)不同目標(biāo)來制定相應(yīng)的檢測方案。

1.1 確定首免時間

每2周采樣檢測母源抗體衰減規(guī)律，準(zhǔn)確把握首免時間，根據(jù)本場情況決定第二次免疫時間是間隔2～3周還是4～5周。應(yīng)急時根據(jù)本場具體發(fā)病時間，結(jié)合疾病的潛伏期再前推1周來確定免疫時間。

1.2 流行病學(xué)的調(diào)查

可以通過檢測疾病發(fā)生或流行擴大情況，結(jié)合季節(jié)變化和區(qū)域情況預(yù)測可能會發(fā)生的疾病。流行病學(xué)調(diào)查作為實驗室檢測診斷的基礎(chǔ)之一，具有深遠(yuǎn)的防控指導(dǎo)意義。

1.3 引種檢測

可采取病原、抗體檢測，二者結(jié)合使用效果最好，檢測被引種場的帶毒情況及其抗體水平，家禽至少按照每批30羽份采樣，而豬則要全采樣。可合并樣本來加速檢測，如出現(xiàn)異常問題再按照合并前的樣本對每份進行檢測，但需全部檢測不能漏檢。

1.4 調(diào)整免疫程序

在結(jié)合重大防控計劃、本場既往發(fā)病史、生產(chǎn)性能情況以及周圍疫病流行情況制定免疫種類的基礎(chǔ)上，通過病原檢測與抗體檢測相結(jié)合來分析與發(fā)現(xiàn)問題，選擇免疫效果好的疫苗，規(guī)范免疫途徑和方法，同時重視細(xì)胞免疫和全身免疫的協(xié)調(diào)配合來合理制定免疫程序，注意考慮季節(jié)性免疫及疫苗間的相互干擾和不同免疫方法產(chǎn)生不同免疫力。

1.5 根據(jù)藥敏試驗結(jié)果用藥

根據(jù)藥敏試驗選擇用藥，以快速恢復(fù)動物機體的健康，減少盲目用藥和降低生產(chǎn)成本。對耐藥的菌株進行研究，剔除耐藥基因恢復(fù)藥敏性，還要注意培養(yǎng)基中含有的二價離子對氨基糖苷類藥敏結(jié)果造成的誤差，注意用藥方法與途徑[2]。

1.6 準(zhǔn)確診斷

充分考慮發(fā)病群體的數(shù)量以確定合理的采樣數(shù)量和正確的采樣部位，還要確保正確的運輸方式以保證樣本的新鮮度，再加上實驗室的良好操作規(guī)范，并結(jié)合流行病學(xué)和臨床生產(chǎn)才能做出準(zhǔn)確診斷。不能檢測出什么病原就認(rèn)為是它引起的正在發(fā)生的疾病，以防止誤導(dǎo)生產(chǎn)企業(yè)，這樣才能建立起良好的互信機制。

1.7 有效治療

在準(zhǔn)確診斷的基礎(chǔ)上，通過病理分析了解是原發(fā)性疾病還是繼發(fā)性疾病，結(jié)合飼養(yǎng)管理的改善來制定合理的綜合防治措施，使之行之有效。

1.8 動保產(chǎn)品的評估

一定要結(jié)合臨床表現(xiàn)和實驗室檢測進行評估。可以為養(yǎng)殖場選擇產(chǎn)品和藥物使用劑量提出合理的參考，從而減少異源毒的危害、降低使用成本以及提高食品安全。

1.9 動保產(chǎn)品研發(fā)

分離優(yōu)勢毒株進行免疫原性和細(xì)胞適應(yīng)性的研究，選擇適合開發(fā)疫苗的毒株，并申報相關(guān)課題以進行進一步的研究，為成果轉(zhuǎn)化做好充分的準(zhǔn)備。

2 樣本的采集

2.1 疫苗樣本

采集樣本時機應(yīng)恰當(dāng)，因多數(shù)弱毒疫苗不帶有標(biāo)記基因，病原檢測無法區(qū)分疫苗毒和野毒，禽用疫苗相對容易區(qū)分，而豬用疫苗要在采樣時避開疫苗排毒時間（表1）。

2.2 抗體樣本

家禽的樣本數(shù)量一般每棟30個樣本即可，豬抗體檢測以仔豬不少于15頭、母豬30頭、公豬100%的標(biāo)準(zhǔn)采樣（表2）。

2.3 病料采集

可以根據(jù)疾病流行病學(xué)來初步判斷采樣器官的范圍，結(jié)合臨床不同的發(fā)病時間采集不同的靶器官樣本。由于家禽解剖結(jié)構(gòu)特殊，其采樣相對簡單，如肝、脾、腎和肺；而豬的不同病原在不同時間作用的靶器官不同，具體詳見表3；據(jù)發(fā)病群體的數(shù)量決定檢測比例，每棟（舍）10頭以上病死豬，每單元5頭以上病死豬，按照公豬100%、母豬5%、仔豬2%的比例進行檢測；必須重視免疫群體的健康狀況及應(yīng)答能力。

3 樣本運輸與處理

3.1 標(biāo)記

做好標(biāo)記，如聯(lián)系人、品種、日齡、時間、地點等。

3.2 保存與運輸

樣本立即進入實驗室保存的，則放置于 4 ℃；若需要運輸應(yīng)先經(jīng)-20 ℃冷凍后盡快送到實驗室。運輸時要加足冰塊，6面加冰固定包裝，以在到達(dá)實驗室時仍有冰塊未全部融化為準(zhǔn)，不同的季節(jié)要用不同數(shù)量的冰塊。

3.3 預(yù)處理

在接到樣本后對其進行預(yù)處理：血液樣本要在運輸前進行離心取血清，冷凍運輸。到達(dá)后要進行預(yù)化凍，盡快進行，不能反復(fù)凍融。組織樣本可加PBS液研磨后取上清液，糞便樣本離心取上清液。

3.4 流行病學(xué)調(diào)查

檢測前關(guān)鍵是要進行流行病學(xué)調(diào)查，不能盲目取樣，初步確定可能發(fā)病情況和范圍，結(jié)合引種、周圍疫情、臨床表現(xiàn)和病理剖解進行綜合判斷，為實驗室檢測的大方向奠定基礎(chǔ)。

3.5 檢測方法

如果檢測劑量少，可用RT-PCR方法檢測，可以使用不同的引物進行多種病原檢測，此方法敏感性高但易出現(xiàn)假陽性。要按照國際標(biāo)準(zhǔn)或國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，規(guī)范操作，不能污染樣本。需要結(jié)合抗體檢測時，可使用相應(yīng)的商品化抗體檢測試劑盒進行[3]。

4 誤區(qū)與不足

4.1 首免時間憑經(jīng)驗確定

不同品種的豬或雞由于疫苗種類、動物健康情況和產(chǎn)房管理的不同，免疫程序不同，因此其后代的首免時間也不一樣。

4.2 引種檢測只關(guān)心抗體

引種時關(guān)心抗體檢測水平，對病原檢測不重視。必要時需要到引種場采樣檢測或?qū)嵉乜疾臁?/p>

4.3 免疫程序千篇一律

免疫程序要結(jié)合重大疾病防控計劃、周圍疫情、本場發(fā)病史和本批次的檢測情況進行合理的調(diào)整。

4.4 確診依據(jù)片面

在疾病檢測診斷上，普遍存在檢測到什么病原就認(rèn)為正在發(fā)生什么疾病，不結(jié)合當(dāng)前的流行病學(xué)和臨床情況，造成檢測結(jié)果誤判而誤導(dǎo)生產(chǎn)。

4.5 防治措施不全

防治措施只根據(jù)檢測結(jié)果執(zhí)行，沒有改善飼養(yǎng)管理，導(dǎo)致效果明顯下降，造成養(yǎng)殖場對檢測結(jié)果產(chǎn)生懷疑。

4.6 實驗室信息提供單一

實驗室往往停留在為養(yǎng)殖場提供檢測結(jié)果，具體措施比較粗糙，停留在表面上。應(yīng)加強有效的獸醫(yī)分析和實驗數(shù)據(jù)的應(yīng)用，以上升到生產(chǎn)獸醫(yī)或更高層次的獸醫(yī)角度來思考分析問題，提出綜合措施。

4.7 檢測目標(biāo)缺乏針對性

實驗室在檢測樣本時往往對所有疾病都進行檢測，這既浪費時間又增加成本。在采集樣本時要結(jié)合流行病學(xué)，劃定可能發(fā)病的范圍和發(fā)病的時期，以決定不同的采樣器官，這樣采集的樣本才有代表性，檢測才能既快速又準(zhǔn)確。

4.8 樣本數(shù)量設(shè)定不科學(xué)

采樣數(shù)量不能出于省錢的目的而人為減少，要科學(xué)設(shè)定置信區(qū)間。不同的置信區(qū)間與群體數(shù)量對采集的樣本數(shù)有不同的要求。

4.9 樣本保存不當(dāng)

樣本運輸時常是密閉不保溫，外包裝太薄，冰塊又不是按樣本四周進行環(huán)繞固定，往往到實驗室時因為腐敗或融化而檢測不到病原，耽誤診斷與生產(chǎn)。

4.10檢測不規(guī)范

檢測不按規(guī)范程序進行，隨心所欲的情況時有發(fā)生。檢測結(jié)果時有電泳不清或拖尾，或者結(jié)果出現(xiàn)多種條帶使人產(chǎn)生懷疑，也給許多人找到疾病復(fù)雜不好防治的借口。

4.11 采樣時缺乏了解用藥情況

檢測細(xì)菌樣本在采集時不問是否用過藥物而盲目采樣，導(dǎo)致無法檢測到病原菌，錯過最佳治療時機。

4.12 診斷結(jié)果不科學(xué)

檢測到疾病病原多就盲目判定是病毒繼發(fā)，而沒有根據(jù)病理變化確認(rèn)哪個是原發(fā)性疾病哪個是繼發(fā)性疾病。

4.13 實驗室服務(wù)有待提升

實驗室檢測服務(wù)太局限，要向前延伸到制定與實施合理的采樣和防控方案，向豬場的健康顧問發(fā)展。

4.14 現(xiàn)場執(zhí)行能力有待提高

檢測結(jié)果準(zhǔn)確、措施到位而治療效果不佳的問題時常出現(xiàn)，要學(xué)會現(xiàn)場指導(dǎo)與改善，往往現(xiàn)場把許多習(xí)以為常而不對的作為正確的事來做，另一個是執(zhí)行力問題。

4.15 藥敏試驗

進行藥敏試驗時對培養(yǎng)基離子價數(shù)、pH不關(guān)注，而鎂離子會影響強力霉素的抑菌作用，pH會影響紅霉素的藥效等。藥敏結(jié)果相差很大，易造成誤導(dǎo)用藥。

4.16 設(shè)備維護

自動設(shè)備應(yīng)用系統(tǒng)間的誤差和儀器比對校正問題要重視，這會直接影響結(jié)果，因此要定期請有資質(zhì)的質(zhì)檢部門校準(zhǔn)或矯正。

4.17 員工素質(zhì)低

員工對質(zhì)控的認(rèn)識程度不足，對儀器高度依賴，缺乏綜合分析的能力，出錯的概率很大。操作時應(yīng)以檢測值為中心，減少檢測前與檢測后的誤差，確保實驗室整體檢測質(zhì)量水平。

4.18 檢測目標(biāo)的判斷

分清是需檢測血清還是血漿，血清是指血液凝固后未經(jīng)稀釋的細(xì)胞外成分，血漿則是指加抗凝血劑后血液經(jīng)離心的上清液，要長期關(guān)注檢測分析相關(guān)的質(zhì)量控制。

4.19 實驗室的作用認(rèn)識不清

出現(xiàn)問題時經(jīng)常把實驗室作為“救火隊員”，解決不了就說解決問題的意義不大，不加強日常檢測計劃，而是有病亂求醫(yī)。

5 討論

（1）畜禽疾病檢測機構(gòu)存在許多不足，如只進行ELISA、PCR和細(xì)胞檢測而未進行病理檢測，導(dǎo)致不能準(zhǔn)確診斷；另外，檢測費用高，尤其對豬樣本的檢測，限制了檢測項目的推廣，也缺乏生產(chǎn)獸醫(yī)能把臨床和生產(chǎn)實際結(jié)合進行有效分析和應(yīng)用的實驗大數(shù)據(jù)。

（2）實驗室檢測包括病原微生物診斷分析（病毒、細(xì)菌以及寄生蟲檢測）和血清學(xué)檢測（主要是抗體檢測）。病原微生物檢測用于引種、生物安全監(jiān)控、養(yǎng)殖場疫病診斷與凈化或可能的風(fēng)險預(yù)警，可以實時掌握養(yǎng)殖場病原微生物的感染狀態(tài)，對維持畜禽健康和降低發(fā)病的風(fēng)險或疾病預(yù)警都具有重要的意義，“實驗室檢測”反映了公眾的關(guān)心，這是當(dāng)今公眾熱衷的一個指標(biāo)。對于目前的養(yǎng)殖現(xiàn)狀，我們能在發(fā)病時快速而準(zhǔn)確地診斷出病原，并為相關(guān)的解決方案提出提供重要的依據(jù)。抗體檢測是檢測機體對病原產(chǎn)生的特異性抗體，主要用于根據(jù)抗體水平來評估疫苗的免疫效果和發(fā)病前后抗體變化，以證明我們在診斷疾病時是否存在漏洞，又可了解母源抗體的衰減規(guī)律，為合理制定首免時間提供重要依據(jù)，抗體檢測原則上不要檢測太多。實驗室檢測作為輔助工具，要有生產(chǎn)獸醫(yī)或更高層次的保健或管理獸醫(yī)對檢測數(shù)據(jù)進行合理的分析，并充分結(jié)合臨床表現(xiàn)和流行病學(xué)，提出切實可操作的防治方案。

（3）檢驗數(shù)據(jù)與臨床癥狀不符時，實驗室應(yīng)立即檢視品管控制，重復(fù)檢測，并注意反思和重新審核是否存在人為疏失。若真有錯誤，應(yīng)立即更正并誠心道歉；若數(shù)據(jù)確實正確無誤，送檢單位也應(yīng)與實驗室共同探討原因或是否重新送檢。從采樣到檢測再到出報告需要經(jīng)過許多環(huán)節(jié)，單純的檢驗部分只占一個小環(huán)節(jié)，真正出錯的原因多是人為疏失和對樣本處置不當(dāng)造成的，還有是其他物質(zhì)如藥物產(chǎn)生的干擾。要重視樣本溶血現(xiàn)象，如采血時出血緩慢，卻使用過大的拉力抽??；血液由針筒打入試管時，未先將針頭拔下；抗凝劑過多而血液過少；血液與抗凝劑混合時，搖蕩過猛或過久；未先將血清（漿）與血球分離，即放入冰箱冷凍；放置過久的血液，特別是有添加抗凝劑等因素。

（4）針對實驗室檢測樣本數(shù)量不足問題，重點是病料物流運輸條件受限制和養(yǎng)殖場因怕影響經(jīng)營與撲殺而不愿將疫情公開化，解決這一問題的辦法是由農(nóng)業(yè)部或行業(yè)聯(lián)盟牽頭，實行結(jié)果實時上傳和信息共享，承擔(dān)起區(qū)域動物疾病流行病學(xué)調(diào)查的職責(zé)；再利用物聯(lián)網(wǎng)技術(shù)建立起可視化的遠(yuǎn)程診斷系統(tǒng)，充分利用真正的專家和實踐經(jīng)驗豐富的一線人員之間的思想碰撞優(yōu)勢，形成及時有效的防治措施。國家或聯(lián)盟（協(xié)會）可以利用實時上傳的數(shù)據(jù)進行大數(shù)據(jù)分析，共享信息平臺，建立起適合局部乃至全國的疾病發(fā)病模型來預(yù)測疾病發(fā)生的機制，也就是所謂的管理獸醫(yī)職能的體現(xiàn)，形成全國一盤棋。

參考文獻：

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[3] 劉玉慶，等譯.細(xì)菌抗藥性原著（第2版）[M].北京，化學(xué)工業(yè)出版社，2012：133-136.