淺析豬偽狂犬病的診斷技術(shù)

何明生

摘 要：本文概述了豬偽狂犬病的臨床、病原學(xué)、血清學(xué)以及分子生物學(xué)診斷技術(shù)，以期為尋找合適的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法、制定合理的免疫程序和發(fā)展新型的檢測(cè)方法提供參考。

關(guān)鍵詞：豬偽狂犬病；診斷；應(yīng)用

中圖分類號(hào)：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C 文章編號(hào)：1001-0769（2018）05-0024-02

豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR）是由偽狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）引起的，不同生長(zhǎng)階段的豬都可發(fā)病的一種急性、高度接觸性傳染病，其特征癥狀為發(fā)熱、繁殖障礙、腦脊髓炎等。目前該病在全世界廣泛分布，并有不斷蔓延擴(kuò)大的趨勢(shì)。任何年齡的豬對(duì)偽狂犬病毒耐過后均能形成潛伏感染，且終生帶毒，在一定條件下會(huì)引起復(fù)發(fā)性感染并向外散毒，因此，開發(fā)出快速、準(zhǔn)確的診斷方法對(duì)豬偽狂犬病的預(yù)防、控制具有十分重要的意義。

1 臨床診斷

臨床診斷就是根據(jù)偽狂犬病典型的臨床癥狀、流行病學(xué)特點(diǎn)、病理剖檢、發(fā)病史等信息判斷豬是否患病的過程。豬患偽狂犬病的臨床癥狀在不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同性別表現(xiàn)不同。新生仔豬主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀，消化系統(tǒng)受損，其中對(duì)2～3周齡的仔豬來(lái)說(shuō)死亡率可高達(dá)100%；妊娠母豬感染主要表現(xiàn)為流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎等現(xiàn)象；公豬感染則呈現(xiàn)繁殖障礙以及呼吸系統(tǒng)癥狀。隱性感染的豬不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷來(lái)確診，以便及時(shí)隔離感染豬，控制感染的蔓延。

2 病原學(xué)診斷

病原學(xué)診斷方法主要包括：病毒分離、病毒接種和動(dòng)物感染，該法被稱為PRV診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但存在敏感性較差的問題。通常取鼻咽拭子、陰道拭子以及組織病料，處理后接種在適宜細(xì)胞上，待細(xì)胞出現(xiàn)病變后，進(jìn)行鏡檢或進(jìn)一步電鏡鑒定。而后將分離出的病毒接種到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上，觀察動(dòng)物的發(fā)病情況。

3 血清學(xué)診斷技術(shù)

簡(jiǎn)單、快捷、敏感是血清學(xué)診斷技術(shù)的特點(diǎn)，目前診斷PR常用的血清學(xué)方法有：酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）、乳膠凝集試驗(yàn)（Latex Agglutination Test，LAT）、血清中和試驗(yàn)（Serum Agglutination Test，SNT）、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（Agar Gel Immunodiffusion，AGID）、血凝（Hemagglutination，HA）試驗(yàn)和血凝抑制（Hemagglutination Inhibition，HI）試驗(yàn)。其中ELISA、LAT和SNT被列為國(guó)際貿(mào)易指定實(shí)驗(yàn)技術(shù)。

3.1 ELISA

ELISA是在固體載體上以物理方法將抗體（或抗原）進(jìn)行吸附，隨后在此固相載體上進(jìn)行一系列免疫學(xué)和酶促生化反應(yīng)的免疫酶測(cè)定實(shí)驗(yàn)，具有特異﹑敏感﹑快速﹑簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，適用于實(shí)驗(yàn)室大批量樣本的檢測(cè)﹑產(chǎn)地檢疫及流行病學(xué)調(diào)查等。

3.2 LAT

LAT是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，先用乳膠將抗原包被，緊接著與相應(yīng)血清進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果可在幾分鐘內(nèi)得出，具有操作簡(jiǎn)單﹑方便﹑快速等特點(diǎn)。邱德新等應(yīng)用LAT對(duì)來(lái)自35個(gè)豬場(chǎng)的414份血清進(jìn)行了PRV的抗體檢測(cè)，檢出168份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為98.2%。

3.3 SNT

SNT是世界上多數(shù)國(guó)家診斷PR的法定方法之一，其敏感性和準(zhǔn)確性都較為理想，但操作煩瑣，且受技術(shù)、細(xì)胞等條件限制，不適合作為流行病學(xué)調(diào)查和大批量免疫監(jiān)測(cè)的使用。

4 分子生物學(xué)診斷方法

分子生物學(xué)診斷技術(shù)的敏感性和特異性均高于現(xiàn)有的血清學(xué)方法，是診斷疾病最敏感和最特異的方法。尤其當(dāng)偽狂犬病毒隱性感染時(shí)，僅靠臨床診斷無(wú)法正確判斷，使用分子生物學(xué)技術(shù)可以做出最為細(xì)致的判別，從而及時(shí)隔離出病豬，保障養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益。

4.1 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（Polymerase Chain Reaction，PCR）

PCR的原理與細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過程十分類似，雙鏈DNA分子在臨近沸點(diǎn)時(shí)分離成單鏈的DNA分子，然后以單鏈DNA為模板，DNA聚合酶利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷酸（dNTP）合成新生的互補(bǔ)鏈。PCR反應(yīng)可在數(shù)個(gè)小時(shí)之內(nèi)將幾個(gè)拷貝基因放大數(shù)百萬(wàn)倍。PCR法檢測(cè)速度快，適合PRV的臨床診斷以及流行病學(xué)調(diào)查。該技術(shù)中使用的引物和探針合成方便且適合保存，檢測(cè)時(shí)間短，結(jié)果可靠，同時(shí)還避免了散毒，尤其適合無(wú)PRV國(guó)家的檢疫。

4.2 核酸探針技術(shù)

在多種診斷偽狂犬病的方法中，核酸探針技術(shù)是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)。它具有特異性良好﹑敏感性高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于PRV的診斷和檢測(cè)中。利用生物素和地高辛標(biāo)記的探針，Maes等從三叉神經(jīng)節(jié)診斷出了PRV的DNA。2008年，劉志杰等制備了gE基因核酸探針，最低的檢出量達(dá)到4 pg，與PCR檢測(cè)結(jié)果一致，這些數(shù)據(jù)顯示該核酸探針可用于PRV野毒感染的臨床檢測(cè)。

4.3 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是基于PCR技術(shù)和核酸雜交的原理，在載體（如玻片）上可同時(shí)檢測(cè)多種目的基因。張煥容等首次構(gòu)建了PRV-PPV-JEV檢測(cè)的基因芯片，PRV、豬細(xì)小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）和流行性乙型腦炎病毒（Japanese Encephalitis Virus，JEV）檢測(cè)的新技術(shù)，該基因芯片技術(shù)能夠同步檢測(cè)和鑒別PRV、PPV和JEV，同時(shí)也能夠鑒別PRV的野毒株和基因缺失疫苗株。

4.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一種擴(kuò)增DNA的快速新方法，簡(jiǎn)單、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)是其主要的特點(diǎn)。根據(jù)PRV gE基因保守序列，楊睿等設(shè)計(jì)了4條引物，凍融處理血液病料后加入熒光染料SYBR Green，應(yīng)用LAMP技術(shù)，40 min內(nèi)即檢測(cè)到了PRV的存在。并與標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和豬圓環(huán)病毒血清均不反應(yīng)。與PCR技術(shù)相比，LAMP簡(jiǎn)化了病料的前處理過程，從而縮短了檢測(cè)時(shí)間，靈敏度更高，對(duì)病毒DNA的最低檢測(cè)出質(zhì)量濃度為6.2×10-9 mg/L，比普通PCR高出了100倍。根據(jù)PRV DBP基因上的一段序列，王樹芬等設(shè)計(jì)并合成了3對(duì)LAMP引物，通過加入羅丹明B衍生物指示劑，建立了可視化的LAMP方法，可快速準(zhǔn)確檢測(cè)PRV。

PR的檢測(cè)方法很多，各有其優(yōu)缺點(diǎn)。傳統(tǒng)方法操作較復(fù)雜或耗時(shí)較長(zhǎng)，實(shí)際應(yīng)用中有一定的困難；血清學(xué)方法，特別是鑒別ELISA試劑盒的研制成功和廣泛應(yīng)用，不僅使PRV的檢測(cè)變得簡(jiǎn)便﹑快速﹑敏感，還可以鑒別野毒和疫苗毒；分子生物學(xué)方法具有靈敏度高﹑特異性好等特點(diǎn)，隨著研究的深入和完善將會(huì)越來(lái)越被廣泛應(yīng)用。當(dāng)然，無(wú)論哪一種診斷檢測(cè)方法都不能徹底解決所有問題，可以根據(jù)檢測(cè)目的和要求進(jìn)行選擇和配合應(yīng)用，以期達(dá)到早發(fā)現(xiàn)﹑早解決。同時(shí)，還應(yīng)不斷深入研究，建立更多快速﹑簡(jiǎn)便﹑實(shí)用的檢測(cè)診斷方法，以更好地促進(jìn)該病的綜合防控和疫病凈化工作的開展。