烤煙苗期枯萎病原菌鑒定及室內藥劑毒力測定

張恒 朱迪 何現(xiàn)梅 彭麗娟

摘 要：為了解貴州安龍烤煙苗期枯萎病原菌種類，篩選防治該病害化學藥劑，采用組織分離法對貴州安龍煙苗枯萎病發(fā)病組織進行病原分離，結合形態(tài)特征、rDNA-ITS序列比對鑒定病原菌，并進行致病性測定。選用6種藥劑，采用生長速率法測定供試藥劑對病原菌菌絲抑制率。結果表明，芬芳鐮孢（Fusarium redolens）為引起烤煙枯萎病的病原菌；室內毒力測定表明，40%氟硅唑EC、42.4%唑醚?氟酰胺SC對烤煙枯萎病菌菌絲生長有較好的抑制作用。

關鍵詞：烤煙；芬芳鐮孢；病原鑒定；殺菌劑

中圖分類號：S435.72 文章編號：1007-5119（2018）06-0036-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.06.006

煙草作為我國重要的經濟作物之一，對增加國家財政稅收、促進國民經濟發(fā)展具有重要意義[1-2]。育苗是烤煙生產的首要環(huán)節(jié)，是獲得優(yōu)質、適產、高效、低成本煙葉的先決條件[3]。目前，漂浮育苗是我國最主要的育苗方式[4]，培育得到的煙苗具有根系發(fā)達、苗株健壯、煙苗整齊度高等優(yōu)點，有利于集約化統(tǒng)一管理和實現(xiàn)育苗工場化，煙苗素質標準化，栽培管理專業(yè)化[5-6]。蔣世君[7]研究發(fā)現(xiàn)河南省烤煙苗期發(fā)生煙草灰斑病，羅正友等[8]在貴州省金沙縣和安順市西秀區(qū)煙草漂浮苗上也發(fā)現(xiàn)了煙草灰斑?。ˋlternaria pluriseptata）。汪漢成等[9]在貴州省煙草科學研究院烤煙漂浮育苗大棚中發(fā)現(xiàn)由九州鐮孢菌（Fusarium kyushuense）引起的煙草莖部腐爛病。因此，隨著漂浮育苗技術的廣泛應用，煙草苗期病害發(fā)生有逐漸加重趨勢?？緹熋缙诓『Φ脑\斷與防治，對培育無病壯苗，生產優(yōu)質煙葉具有重要意義。2016年在貴州安龍部分烤煙育苗小棚中發(fā)生了苗期枯萎病，采集苗期枯萎病標本，經實驗室分離、純化和鑒定，并進行室內藥劑毒力測定。以期為烤煙苗期枯萎病害的診斷、防治提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

烤煙苗期枯萎病病害標本于2016年4月22日在貴州安龍棲鳳街道吳家莊育苗小棚采集，品種為云煙87。致病性測定煙苗由貴州大學農學院植物病理實驗室培育，品種為云煙87。

1.2 供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂凝膠（PDA）培養(yǎng)基[10]：用于烤煙苗期枯萎病菌分離、菌落外觀形態(tài)觀察、室內藥劑篩選。馬鈴薯葡萄糖（PD）培養(yǎng)基[10]：用于烤煙苗期枯萎病菌接種用孢子懸浮液制備?？的塑叭~片（CLA）培養(yǎng)基[11]：用于烤煙枯萎病菌顯微形態(tài)觀察。

1.3 病原菌分離鑒定

1.3.1 病原菌分離 取發(fā)病煙苗根、莖部，采用組織分離法分離，純化后菌株保存于PDA斜面培養(yǎng)基上和無菌水中，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹10]。

1.3.2 致病性測定 采用孢子懸浮液蘸根法、根部刺傷法、土壤接種法等[10]3種方法將病原菌接種到健壯無病的云煙87煙苗上。用血球計數(shù)板將分生

孢子數(shù)調節(jié)到1×104個/mL，孢子懸浮液現(xiàn)配現(xiàn)用[12]。每種方法接種5株煙苗，4次重復，以無菌水為對照，7 d后觀察煙苗發(fā)病情況。對接種發(fā)病煙苗根、莖部進行組織分離，純化培養(yǎng)的菌株與1.3.1所述菌株同時進行鑒定。

1.3.3 病原菌形態(tài) 將菌株接種于PDA、CLA平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落在PDA平板上外觀形態(tài)；5 d后從CLA平板上挑取少許菌絲制片鏡檢，觀察大型分生孢子、小型分生孢子、產孢細胞、厚垣孢子等，測量大型、小型分生孢子大小（n=50）。參考文獻[13]的分類系統(tǒng)，對分離的病原菌進行形態(tài)鑒定。

1.3.4 病原菌rDNA-ITS序列 用滅菌手術刀刮取足量病原菌絲，使用微量基因組DNA試劑盒（型號：D3096，廠家：Omega Bio-Tek公司）提取病原菌DNA，PCR反應體系與擴增程序參見文獻[14]。

PCR擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結果經Blast后與NCBI數(shù)據(jù)庫中已知序列進行同源性比較。依據(jù)致病性測定結果、病原菌形態(tài)特征，結合同源性比較結果，鑒定烤煙苗期枯萎病菌種類。

1.4 室內藥劑毒力測定

1.4.1 供試藥劑 6種供試藥劑種類及生產廠家見表1。

1.4.2 毒力測定 采用生長速率法測定供試藥劑對烤煙枯萎病菌菌絲生長的抑菌活性[10]。采用含毒介質法，將6種藥劑稀釋不同倍數(shù)后，配制不同濃度的PDA含藥培養(yǎng)基平板[15]。培養(yǎng)6 d后，十字交叉劃線法測量菌落直徑，測量結果取平均值，計算供試藥劑的相對生長抑菌率[16]。

抑菌率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑-菌餅直徑）×100

根據(jù)各藥劑生長抑制率和濃度值建立毒力方程y=a +bx，得各藥劑的EC50值及相關系數(shù)r。數(shù)據(jù)處理分析軟件為農藥室內生物測定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（武漢市蔬菜科學研究所﹑農業(yè)部農藥檢定所）[17]。

2 結 果

2.1 危害癥狀

煙苗染病后，初期表現(xiàn)為葉片輕微褪綠，植株矮小，長勢不好；根部受害明顯，主根和須根腐爛發(fā)黑；發(fā)病嚴重時葉片發(fā)黃至發(fā)白失綠，甚至死亡（圖1）。

2.2 病原菌致病性測定

接種7 d后觀察，孢子懸浮液蘸根接種（圖2a）、土壤接種（圖2b）和根莖部刺傷接種（圖2c）均使煙苗發(fā)病。染病后，初期表現(xiàn)為葉片萎蔫發(fā)黃，根部受害明顯，主根和須根短小，根量少，腐爛發(fā)黑（圖3a）。

從回接煙苗病株組織再次分離病原物，結合形態(tài)學特征與ITS序列，兩次分離的培養(yǎng)物一致，符合柯赫氏法則，證明該菌株為烤煙苗期枯萎病菌。

2.3 病原菌形態(tài)特征

CLA培養(yǎng)基上，菌絲蛛網狀，菌落白色，無色素。由圖4看出，PDA培養(yǎng)基上，菌落初為白色，后逐漸轉為青蓮色，菌落平滑，具一圈輪紋，菌絲羊毛狀，生長初期菌絲生長較快，呈放射狀，28 ℃培養(yǎng)4 d后，菌落直徑為4.2 ～ 4.6 cm。大型分生孢子為馬特型，分隔較不明顯，多為1 ～ 3 隔，基胞、頂胞稍顯鈍圓，量度為 31.2～42.2 μm×3.7～6.3 μm。小型分生孢子數(shù)目較多，多為卵形或腎形，分隔不明顯，多為0～1隔，量度為6.2 ～14.34 μm×2.30～4.13 μm。產孢細胞為單瓶產孢梗，未觀察到厚垣孢子。根據(jù)以上形態(tài)特征，初步鑒定為芬芳鐮刀菌（Fusarium redolens）。

2.4 病原菌rDNA-ITS序列比對

病原菌rDNA-ITS序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列比對，結果顯示，與芬芳鐮刀菌（F. redolens）同源性為100%。

2.5 室內毒力測定

表2結果表明，6種藥劑對烤煙枯萎病菌菌絲生長均有不同程度抑制作用，藥劑濃度與菌絲生長抑制程度成正相關。6種藥劑對烤煙枯萎病菌的毒力從大到小依次為40%氟硅唑EC > 42.4 %唑醚?氟酰胺SC > 40 %百菌清SC > 70% 丙森鋅WP > 64 %噁霜靈錳鋅WP > 2 %春雷霉素SL。其中40 %氟硅唑EC抑菌效果最好，EC50值為0.64 mg/L；其次是42.4 %唑醚?氟酰胺SC，EC50值為4.94 mg/L；抑菌效果最差的是2 %春雷霉素SL，EC50值為1 025.86 mg/L。6種藥劑對烤煙枯萎病菌菌絲抑制作用見圖5～10。

3 討 論

由鐮孢屬（Fusarium）真菌引起的植物枯萎病，世界范圍內廣泛分布，寄主包括經濟作物、茄科作物、瓜類作物、花卉植物等[18]。枯萎病菌為土壤習居菌，主要以菌絲體、厚垣孢子在土壤及未腐熟綠肥中越冬，主要靠病苗、病土和流水傳播[19]。汪漢成等[20]對貴州主栽的4個烤煙品種裸種進行帶菌檢測，4個烤煙品種裸種上均攜帶病原真菌，優(yōu)勢菌群主要為鏈格孢屬（Alternaria）、芽枝孢菌屬（Cladosporium）、鐮孢菌屬（Fusarium）和赤霉菌屬（Gibberella）等4個屬的真菌。由此推斷，安龍煙苗發(fā)生枯萎病的原因一種可能是育苗基質或育苗盤未徹底消毒，其中可能含有引致安龍烤煙苗期枯萎病的鐮孢屬真菌；另一種可能是烤煙種子帶菌。雖然烤煙包衣劑內含有殺菌劑，但添加的殺菌劑有可能對鐮孢屬真菌無抑制作用。對烤煙苗期土壤或種子傳播的病害，選用無病種子和育苗基質，做好育苗大棚和育苗盤的消毒，可一定程度降低該類病害發(fā)生幾率。

汪漢成等[9]在貴陽發(fā)現(xiàn)的引起烤煙苗期莖部腐爛病的病原菌為九州鐮孢（F. kyushuense）。本文從發(fā)病煙苗上分離致病菌，結合rDNA-ITS序列比對與形態(tài)特征，鑒定安龍烤煙苗期枯萎病的病原菌為芬芳鐮孢（F. redolens）。2種苗期病害從癥狀上看，九州鐮孢主要引起煙苗腐爛，芬芳鐮孢主要引起煙苗枯萎。

目前，利用化學藥劑防治作物枯萎病仍是較為有效的方法之一，我國生產上用于防治作物枯萎病較好的藥劑主要有唑類、甲酯類、酰胺類等[21]。本文通過室內毒力測定發(fā)現(xiàn)，40%氟硅唑EC對烤煙苗期枯萎病菌抑制效果最好，其次為42.4%唑醚·氟酰胺SC。因此40%氟硅唑EC和42.4%唑醚·氟酰胺SC可做為防治烤煙苗期枯萎病的藥劑，防治效果需進一步結合田間試驗確定。

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