絨毛狀煙草和林煙草全長cDNA文庫構(gòu)建及EST序列分析

孫榕 陳明麗 解敏敏 孫玉合 龔達平

摘 要：表達序列標簽（EST）廣泛應用于基因功能研究和分子標記開發(fā)。以普通煙草兩個二倍體祖先種絨毛狀煙草（Nicotiana tomentosiformis， TT）和林煙草（Nicotiana sylvestris， SS）多個組織為試驗材料，使用CloneMiner cDNA文庫構(gòu)建方法構(gòu)建了均一化全長cDNA文庫，測序并進行序列拼接、功能注釋、進化分析和標記開發(fā)。絨毛狀煙草和林煙草均一化全長cDNA文庫容量分別為0.72×106和1.12×106 pfu/mL，重組率分別約為94%和93%，插入片段平均長度為1.4 kb。測序獲得20 953條EST序列，拼接為10 504個unigenes。與普通煙草EST序列混合拼接，產(chǎn)生34 450條contigs，123 511條singletons，煙草異源四倍體中T和S基因與絨毛狀煙草、林煙草之間的相似性遠高于兩個二倍體祖先種之間。預測獲得104 915個編碼序列，其中73 670個序列包含功能結(jié)構(gòu)域，81% unigenes在番茄中具有同源基因。鑒定了11 869個微衛(wèi)星位點（SSR）和25 209個單核苷酸多態(tài)性位點（SNP）。這些數(shù)據(jù)信息對于煙草基因功能研究和分子育種具有重要價值。

關鍵詞：煙草；cDNA文庫；EST；SNP；SSR

中圖分類號：S572.03 文章編號：1007-5119（2018）05-0009-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.002

Abstract： Expressed sequence tags （EST） are widely used in gene function research and molecular marker development. In order to obtain a large number of EST sequences of tobacco， a variety of tissues and organs from Nicotiana tomentosiformis and Nicotiana sylvestris were taken as plant materials， and two full-length enriched cDNA libraries were constructed using the CloneMiner cDNA method. The EST sequences were used for sequence assembly， functional annotation， phylogenetic analysis and molecular marker development. The normalized full-length cDNA libraries were constructed successfully from Nicotiana tomentosiformis and Nicotiana sylvestris. The titer were 0.72×106 and 1.12×106 pfu/mL， respectively， and the recombination rates were approximately 94% and 93%， respectively. The average length of inserted cDNA fragments was 1.4 kb. 20 953 ESTs were generated from the full-length enriched cDNA libraries， and assembled into 10 504 unigenes. All of the ESTs from allopolyploid tobacco （Nicotiana tabacum） and its two diploid progenitors， Nicotiana tomentosiformis and Nicotiana sylvestris were assembled， resulting in 34 450 contigs and 123 511 singletons. The global assembly showed that the transcripts from the resident T- and S-genomes in the allotetraploid nucleus were more closely related to their diploid homologs than they were to each other. In total， 104 915 coding sequences were identified， of which 73 670 sequences contained functional domains. Approximately 81% of the unigenes had homologs in tomato. Furthermore， we found 11 869 putative simple sequence repeats （SSR） and 55 369 single nucleotide polymorphisms （SNPs）. The EST resources have important implications for gene function research and molecular breeding.

Keywords： tobacco； full-length cDNA； EST； SNP； SSR

煙草屬于茄科植物，不僅是重要的經(jīng)濟作物，也是研究異源多倍體的重要模式物種[1-3]。普通煙草為異源四倍體（2n=48），可能是由兩個二倍體野生煙草絨毛狀煙草（N. tomentosiformis，TT， 2n=24）和林煙草（N. sylvestris， SS， 2n=24）種間雜交后通過染色體加倍形成[4-5]。普通煙草基因組大小約4.5 G[6]，重復序列比例高[7-8]，具有高度的復雜性?；赥GI的基因標簽數(shù)據(jù)，BINDLER等[9]開發(fā)SSR標記構(gòu)建了一張高密度的普通煙草遺傳圖譜。WU等[10]利用單拷貝的直系同源基因（single-copy conserved ortholog set，COSII）和簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）標記，比較了兩個二倍體祖先煙草和普通煙草的遺傳圖譜，發(fā)現(xiàn)普通煙草相比二倍體經(jīng)歷了更多的染色體重排。最近，采用二代測序技術相繼完成了林煙草、絨毛狀煙草和普通煙草的基因組測序[11-14]。

全長cDNA序列分析是獲得基因全長信息的最直接有效的一種方法。全長cDNA克隆具有完整的轉(zhuǎn)錄序列，包括編碼區(qū)（CDSs）和非翻譯區(qū)（UTRs），這有助于基因組測序完成后基因的準確預測。煙草EST序列信息是開展基因功能研究[15-16]、分子標記開發(fā)[17]、基因芯片開發(fā)[18]等的重要基礎。美國煙草基因組計劃、歐洲煙草測序項目組和日本煙草公司等構(gòu)建了普通煙草品種不同發(fā)育時期的多個cDNA文庫，分別獲得80 783條、58 969條和65 102條EST序列。二倍體祖先煙草的基因組草圖已經(jīng)測序完成，但是關于全長轉(zhuǎn)錄本的信息還很少，因此開展煙草全長cDNA研究具有重要價值。本研究構(gòu)建了兩個二倍體祖先種絨毛狀煙草和林煙草的全長cDNA文庫，高效測序并獲得了大量EST，利用生物信息學工具結(jié)合普通煙草EST進行了拼接，并對序列分化和基因功能進行了分析，開發(fā)了大量的SNP和SSR標記，為煙草的基因功能研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 cDNA文庫構(gòu)建

絨毛狀煙草和林煙草種植在中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所溫室。收集幼苗、根、莖、葉和花等組織儲存在–80 ℃?zhèn)溆?。使用Trizol 提?。↖nvitrogen） 各組織總RNA，全長cDNA采用GenRacerTM試劑盒富集（Invitrogen）。cDNA文庫使用CloneMiner II 試劑盒（Invitrogen）構(gòu)建并插入到載體pDONR222，再通過基因組飽和雜交，構(gòu)建均一化文庫。為了評估文庫的質(zhì)量，隨機挑取60個克隆通過載體特異性引物PCR擴增檢測，通過瓊脂糖凝膠電泳估計插入片段大小。

1.2 EST測序、組裝和功能注釋

隨機挑取cDNA克隆在ABI3730DNA分析儀（Applied Biosystems公司）上從5′進行單向測序。利用PHRED[19]將峰值信息轉(zhuǎn)換為序列文件。利用LUCY和Seqclean程序過濾低質(zhì)量區(qū)域、載體序列和poly（A）序列，得到高質(zhì)量序列[20]。使用CAP3程序在95%以上相似性和50 bp以上重疊的參數(shù)下進行聚類拼接[21]。將起始密碼子上游的序列定義為5′-UTRs。使用BLASTN軟件將unigenes與Sol數(shù)據(jù)庫中絨毛狀煙草和林煙草的CDS序列進行比對，分析unigenes的5′-UTR長度。所有的unigenes使用ESTScan程序搜索開放閱讀框（open reading frames， ORF）[22-23]。采用interproscan程序進行GO注釋[24]。擬南芥基因的GO注釋信息來自TAIR 數(shù)據(jù)庫[25]。

1.3 SSR標記和SNP標記挖掘

使用MISA程序分析微衛(wèi)星序列（microsatellite，SSR）。重復單元為2～6個核苷酸堿基，最小重復次數(shù)分別是：2堿基重復單元為6次，3堿基重復單元為5次，4堿基重復單元為4次，5堿基重復單元為3次，6堿基重復單元為3次。兩個相鄰的SSR重復單元之間間隔最大長度設置為100 bp。利用Perl腳本AutoSNP對CAP3拼接產(chǎn)生的比對序列進行SNP鑒定[26]。

2 結(jié) 果

2.1 cDNA文庫構(gòu)建和EST測序組裝

利用不同組織的混合RNA，構(gòu)建了二倍體野生煙草絨毛狀煙草和林煙草的全長均一化文庫，文庫容量分別為0.72×106和1.12×106 pfu/mL，重組率分別約為94%和93%，文庫插入片段平均大小約為1.4 kb。隨機挑選22 525個克隆進行5′末端測序，共產(chǎn)生20 953條EST序列。EST序列的長度在100～

908 bp之間，平均長度為671 bp。其中10 450條EST序列來源于絨毛狀煙草（GenBank序列號：JZ959365-JZ969801），10 503條EST序列來源于林煙草（GenBank序列號：JZ948884-JZ959364）。通過聚類拼接，絨毛狀煙草獲得4805個unigenes，包括1202個contigs和3603個singletons ；林煙草獲得5699個unigenes，包括1410個contigs和4289個singletons。其中，88%的絨毛狀煙草unigenes和84%林煙草unigenes序列中EST序列數(shù)量都少于6條，說明均一化文庫的冗余度相對較低。將unigenes與基因組中預測的CDS序列比較來鑒定UTR區(qū)域。絨毛狀煙草和林煙草中，2917個基因和3838個基因具有完整的ATG起始序列，UTR長度分布如圖1，大多數(shù)基因的UTR長度小于200。

2.2 EST組裝

從Genbank數(shù)據(jù)庫中，搜集獲得了普通煙草40多個文庫共計334 382條 EST序列，多于1000條EST序列的文庫信息如表1[15-16，18，27-30]。這些文庫來源包括烤煙品種K326、Hicks Broadleaf、白肋煙Burley 21、TN86、香料煙Samsun和雪茄煙Petit Havana等在不同條件下的根、花、葉、腺毛、花等組織和細胞。

將普通煙草與林煙草和絨毛狀煙草共計347 022條EST序列進行組裝，獲得了34 450條contigs和123 511條singletons（共157 961個unigenes）。contigs的長度從107到3502 bp，平均長度為879.6 bp。每個contig包含的EST數(shù)量平均為14.8條（最多的為1158條），平均每個堿基的覆蓋度為4.4倍。

3個煙草屬物種混合組裝構(gòu)成的contig數(shù)量分布如圖2。普通煙草、絨毛狀煙草和林煙草共有EST成員的contig是376條；絨毛狀煙草與普通煙草共同組成的contig是3103條；林煙草與普通煙草共同組成的contig是2761條；普通煙草特異的contigs 有28 210條。二倍體煙草沒有特異的contig，說明二倍體煙草沒有與普通煙草分化程度很大的特異基因序列。這些結(jié)果表明，普通煙草中T基因組和S基因組與二倍體基因組的相似程度遠比它們之間的相似程度更高。但是，在絨毛狀煙草和林煙草中仍然分別有2904和2225條EST序列屬于單一序列，沒有與普通煙草的EST構(gòu)成contig?？赡芘c文庫質(zhì)量、表達差異和測序錯誤等原因造成的文庫偏好有關。

2.3 基因預測、功能注釋及與其他植物基因的比較分析

通過ESTScan程序在104 915個unigenes（66.4%）中發(fā)現(xiàn)了開放閱讀框（ORF），平均長度為524 bp（最小片段為150 bp，最長片段為3486 bp）。這些預測的煙草ORF序列長度相比基因組預測的CDS長度要短，可能是沒有拼接出基因全長造成的。小部分unigene可以與NR數(shù)據(jù)庫有較好的比對結(jié)果，說明ESTScan并沒有鑒定準確，可能與ESTScan程序使用擬南芥的參數(shù)有關。

在104 915個ORF序列中，73 670個蛋白產(chǎn)物至少包含一個注釋的Pfam結(jié)構(gòu)域。其中，出現(xiàn)次數(shù)最多的結(jié)構(gòu)域是Pkinase （Pfam： PF00069），這是一個包含蛋白激酶催化功能的結(jié)構(gòu)保守的蛋白結(jié)構(gòu)域。其他的結(jié)構(gòu)域包括RNA識別基序（RNA recognition motif）、亮氨酸重復序列（leucine rich repeat）、WD40重復序列（WD40 repeat）、鋅指結(jié)構(gòu)域（Zinc finger domains）[32]和細胞色素P450。大量研究表明，這些結(jié)構(gòu)域在其他植物中也廣泛存在。

GO注釋將基因功能分為細胞組分、分子功能和生物學過程3個部分和各個小類。將煙草和擬南芥的GO注釋結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，整體上兩個物種的基因功能分類是相似的，但在輔助轉(zhuǎn)運蛋白（auxiliary transport protein）、蛋白標簽（protein tag）、金屬伴侶（metallochaperone）等功能類別中具有顯著差異（圖3）。將預測的104 915個煙草基因的氨基酸序列與擬南芥、水稻、楊樹、大豆、葡萄和番茄的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比對分析（E值>1E-10）。結(jié)果表明（圖4），預測的煙草基因氨基酸序列與茄科植物，特別是番茄基因具有高度的相似性，僅有19%的煙草蛋白序列在番茄中沒有相似序列；而在水稻中煙草有33%的蛋白沒有序列相似性。圖4的曲線也反應出了煙草與其他物種的分化程度，與同屬于茄科的番茄關系最近。

2.4 SSR標記的鑒定

從152 891個unigenes中共鑒定了10 424個SSR位點。絕大多數(shù)序列僅含有1個SSR位點，1209個基因具有多個SSR位點。共計開發(fā)了11 869個煙草EST-SSR標記，包括二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的SSR類型。其中，945個SSR位點是復合形式。二核苷酸和三核苷酸的SSR類型為主要類型，共占72.51%。二核苷酸重復序列有4434條、三核苷酸重復序列有4054條、四核苷酸重復序列有516條、五核苷酸重復序列有1273條，六核苷酸重復序列有1592條。煙草EST-SSR重復單元類型統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，在二核苷酸SSRs中AG/CT類型的重復序列最多，占二核苷酸重復序列的56.2%。在三核苷酸SSRs中AAG/CTT類型的重復序列是最豐富的，占總數(shù)的38.9%（表2）。

重復單元重復次數(shù)最多的是二核苷酸SSRs，AG/CT類型的重復單元最大重復數(shù)量為53次（表3）。

本研究獲得的煙草EST序列共計94.75 Mb，SSR的密度為10 kb分布12.5個SSRs，頻率約為6.8%。這些新的標記可用于遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和比較基因組研究。

2.5 SNP標記的鑒定

從33 734個contigs中共鑒定103 027個SNP和24 760個插入/刪除（insertions/deletions，indels）位點。測序錯誤導致基于EST序列鑒定的SNP可信度比較低，而具有較高冗余度和共分離值的SNP最有可能是真實的遺傳變異[31-32]。使用兩個或兩個以上的冗余評分進行過濾后，獲得42 355個SNP標記和11 014個InDel標記，其中SNP標記類型包括26 294個轉(zhuǎn)換和16 061個顛換。大多數(shù)過濾后的SNPs是從包含4個以上序列的contigs中鑒定的。由于普通煙草是異源四倍體，基因組包含許多高度同源的基因。通過刪除SNP頻率大于20 SNP/kb的位點，共獲得25 209個SNP。

3 討 論

由于煙草是異源四倍體，基因組重復序列比例高，2013年煙草科研工作者采用新一代測序技術結(jié)合BAC-to-BAC策略完成了普通煙草及其二倍體祖先絨毛狀煙草和林煙草的基因組測序。但對煙草基因組中基因的預測和功能的注釋遠落后于基因組測序。煙草EST數(shù)據(jù)是煙草基因組進行基因預測和功能注釋的重要信息，目前還沒有開展絨毛狀煙草和林煙草全長cDNA文庫構(gòu)建及EST 測序的研究報道。本研究采用CloneMiner cDNA文庫構(gòu)建方法構(gòu)建了兩個二倍體祖先絨毛狀煙草和林煙草的均一化全長cDNA文庫。相比轉(zhuǎn)錄組測序，更有利于發(fā)現(xiàn)基因的全長信息，為研究煙草基因功能提供了一條重要途徑。此外，全長基因是評估煙草基因組測序組裝質(zhì)量的重要指標之一。本研究獲得的絨毛狀煙草和林煙草EST數(shù)據(jù)有效的評估了中國煙草基因組計劃組裝拼接的二倍體煙草基因組，基本覆蓋了所有基因[12-14]。

通過EST測序和拼接，絨毛狀煙草和林煙草分別獲得4805個和5699個unigenes。與煙草基因組預測的7萬個基因相比[12-14]，本研究獲得的基因數(shù)量還相對有限，兩個全長cDNA文庫還需要挑選更多的克隆進行EST測序。Genbank數(shù)據(jù)庫中，報道了大量的普通煙草EST數(shù)據(jù)，為煙草基因組提供了大量的基因信息。通過與普通煙草EST序列混合拼接，獲得了157 961個unigenes，預測獲得104 915個編碼序列。這些數(shù)據(jù)對于煙草基因組的基因預測和功能研究具有非常重要的價值。

分子標記在煙草基因定位和品種改良上發(fā)揮著重要作用[33-36]。本研究鑒定了11 869個微衛(wèi)星位點（SSR）和25 209個單核苷酸多態(tài)性位點（SNP）。相比傳統(tǒng)的分子標記，SSR和SNP標記具有數(shù)量多、分布廣泛的優(yōu)點。目前，最高密度的兩個煙草遺傳圖譜分別是用SSR和SNP標記構(gòu)建的[17，37]。本研究基于EST數(shù)據(jù)鑒定的大量SSR和SNP標記，為開展遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位克隆和分子標記輔助育種打下了良好基礎。

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了煙草二倍體祖先種絨毛狀煙草和林煙草的均一化全長cDNA文庫，獲得了超過2萬條EST序列信息和10 504個unigenes，并且64.3%的unigenes具有5'-UTR。將這些序列與以前報道的普通煙草EST序列進行組裝和基因注釋，解析了異源四倍體同源基因間的分化程度，鑒定了10 424個SSR標記和25 209個SNP/indel標記。這些數(shù)據(jù)為煙草基因組注釋、基因功能研究和分子育種工作提供了非常有價值的信息。

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