利用GBS技術(shù)開發(fā)煙草SNP標(biāo)記及遺傳多樣性分析

蔡露 楊歡 王勇 李廷軒 陳光登

摘 要：研究煙草種質(zhì)資源的遺傳背景，為煙草種質(zhì)資源的高效利用提供依據(jù)。采用GBS（genotyping-by-sequencing）技術(shù)，挖掘92份煙草種質(zhì)資源的SNP位點，并進行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果表明，測序共獲得了147.165 Gb數(shù)據(jù)，平均每個樣本1.599 Gb，篩選后共獲得93 685個高質(zhì)量的SNP位點；不同地理來源煙草群體等位基因數(shù)（Na）為1.27～1.93，觀測雜合度（Ho）變化范圍為0.22～0.76，期望雜合度（He）為0.32～0.59，多態(tài)性位點數(shù)（PLN）范圍為15 877～44 249，多態(tài)性位點比率（PPL）為26.61%～74.17%，遺傳多樣性指數(shù)（H）為0.19～0.52，遺傳距離（GD）為?0.0148～0.3849?；谶z傳距離的NJ聚類將材料劃分為兩個類群；群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，本研究所用材料基于模型可劃分為4個亞群。通過GBS技術(shù)得到的測序數(shù)據(jù)量較大且質(zhì)量較高，群體多態(tài)性較高，整體遺傳多樣性偏低，群體結(jié)構(gòu)劃分與種質(zhì)來源不完全相關(guān)。

關(guān)鍵詞：煙草；GBS；SNP；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S572.03 文章編號：1007-5119（2018）05-0017-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.05.003

Abstract： To understand the diversity and genetic structure of tobacco germplasm resources and provide an important theoretical foundation for resource use， GBS （genotyping-by-sequencing） technology was used to discover SNP loci for 92 tobacco germplasm resources. With the SNPs genotyping data， the genetic diversity and genetic structure were analyzed. By using GBS， a total of 147.165 Gb of sequences was generated from the 92 tobacco germplasms， and each sample produced 1.599 622 Gb in average. After being screened， a total of 93 685 of high-quality SNP sites was retained. The range of number of alleles （Na） for different geographic sources of tobacco population was 1.27-1.93. The observed heterozygosity （Ho） was 0.22～0.76. The expected heterozygosity （He） was 0.32-0.59. The number of polymorphic loci was 15 877-44 249. The percentage of polymorphic loci （PPL） was 26.61%-74.17%. The genetic diversity index （H） was 0.19-0.52. The genetic distance （GD） was ?0.0148-0.3849. The genetic distance-based NJ clustering was used to classify the materials into two groups. The results of the population structure based on a model-based method indicated that these materials could be divided into four subgroups. In summary， the sequencing data obtained by GBS technology provide an effective and high feasible approach to assist the genotyping of 92 tobacco accessions with high population polymorphism and low genetic diversity abundance. The division of population structure was not completely related to the geographic origin of the germplasm.

Keywords： tobacco； GBS； SNP； genetic diversity； population structure

煙草（Nicotiana tabacum L.）是我國重要的經(jīng)濟作物之一，作為世界上最大的煙草生產(chǎn)國，我國煙草育種面臨親本匱乏、品種遺傳背景狹窄、盲目性、重復(fù)性大等問題[1]。種質(zhì)資源是煙草資源創(chuàng)新和遺傳育種的物質(zhì)基礎(chǔ)，遺傳多樣性評價可將資源有效用于種質(zhì)創(chuàng)新和品種選育[2]。目前對煙草種質(zhì)資源除利用表型特征進行鑒定外[3]，分子標(biāo)記技術(shù)和基因測序技術(shù)也得到了廣泛應(yīng)用[4-5]。目前應(yīng)用于煙草中的分子標(biāo)記主要包括AFLP[6]、SSR[7]、ISSR[8]、DarT[9]和SRAP[10]等，并用于煙草種質(zhì)遺傳多樣性分析[11]、遺傳圖譜構(gòu)建[12]、QTL分析[13]等方面。但這些標(biāo)記技術(shù)因具有通量小、精確性低、成本高及不能在基因組上廣泛分布等特點限制了其進一步發(fā)展與應(yīng)用[14]。SNP是在基因組水平上由單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性，相較其他分子標(biāo)記具有多態(tài)性好、能在全基因組上廣泛均勻分布的特點，并且隨著高通量測序及生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析技術(shù)的發(fā)展，可完成大規(guī)模自動化檢測[15]。GBS是在第二代測序基礎(chǔ)上發(fā)展的簡化基因組測序技術(shù)，利用酶切加標(biāo)簽的方法，通過測序可獲得酶切位點附近基因序列信息，進而檢測大量高準(zhǔn)確性的SNP變異信息[16]，對了解種質(zhì)資源的遺傳背景和系統(tǒng)演化，研究群體親緣關(guān)系及群體結(jié)構(gòu)具有重要意義[17]。本研究以92份煙草種質(zhì)為材料，采用GBS技術(shù)挖掘SNP標(biāo)記，并進行遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)分析，為煙草種質(zhì)資源的高效利用及育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗用煙草種質(zhì)資源92份（表1），種子由四川省煙草公司涼山州公司提供。

1.2 研究地點與方法

1.2.1 試驗地點 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研農(nóng)場。

1.2.2 培養(yǎng)方法 煙草種子于漂浮盤中育苗，待幼苗長至7～8片葉時，每份煙草品種選擇生長一致的4株取幼嫩葉片，混合取樣，放入液氮罐中保存待用。

1.2.3 基因組DNA提取和GBS文庫構(gòu)建 取約1 g的嫩葉進行研磨，依照TaKaRa MinBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit（寶生物工程大連有限公司）試劑盒法提取基因組DNA。經(jīng)濃度及純度檢測后的高質(zhì)量DNA用于GBS文庫構(gòu)建和測序。首先應(yīng)用限制性內(nèi)切酶對基因組進行酶切，加上帶有條形碼的接頭后，對每個樣品進行擴增，然后對樣品進行混合，電泳回收350～400 bp區(qū)間的DNA條帶，純化后產(chǎn)物用于測序，測序反應(yīng)在Illumina HiSeq 150測序平臺上進行雙末端150 bp的測序。

1.2.4 SNP鑒定 采用BWA（Burrows-Wheeler Aligner）程序?qū)y序獲得的高質(zhì)量序列匹配到參考基因組（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term

=common+tobacco%5Borgn%5D）；利用Samtools軟件進行群體SNP檢測；采用貝葉斯模型檢測群體中的多態(tài)性位點，對獲得的SNPs進行過濾；通過ANNOVAR軟件對SNP檢測結(jié)果進行注釋。

1.2.5 遺傳數(shù)據(jù)分析 利用POPGENE version 1.32計算平均等位基因數(shù)（Number of alleles， Na）、觀測雜合度（Observed heterozygosity， Ho）、期望雜合度（Expected heterozygosity， He）、多態(tài)性位點數(shù)（Number of polymorphic loci， PLN）、多態(tài)性位點比率（Percentage of polymorphic loci， PPL）、遺傳多樣性指數(shù)（H）及遺傳距離（Genetic Distance， GD）；運用TreeBest軟件計算距離矩陣，通過鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建NJ聚類；采用FRAPPE軟件分析群體的遺傳結(jié)構(gòu)；利用SPSS 22.0進行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 測序質(zhì)量

通過GBS測序，92個煙草樣本共產(chǎn)生147.165 Gb的總測序數(shù)據(jù)量，去除低質(zhì)量的序列后，高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)量為147.130 Gb，平均每個樣本為1.599 Gb。測序質(zhì)量較高（Q20≥94.69%、Q30≥86.87%），GC分布正常，群體樣本與參考基因組的平均比對率為99.62%，本試驗的樣本與參考基因組有極高的相似性。序列至少有一個堿基的平均覆蓋度為6.51%，至少有4個堿基的平均覆蓋度為2.47%。利用Samtools軟件檢測后共獲得942 697個SNP位點，經(jīng)過條件為測序深度2×、Miss0.3、次要等位基因頻率（MAF）>0.01的過濾后，最后共獲得93 685個高質(zhì)量的SNP位點。對這些高質(zhì)量SNP進行群體SNP注釋（圖1），發(fā)現(xiàn)SNP標(biāo)記最多位于基因間區(qū)（Intergenic），約占總量的92.02%，3.48%位于基因中內(nèi)含子區(qū)域（Intronic），1.61%位于基因中外顯子區(qū)域（Exonic），1.50%和1.37%分別位于基因的上游（Upstream）和下游（Downstream），位于基因上游1 kb區(qū)域同時又位于另一基因下游1 kb區(qū)域（upstream/downstream）的占0.02%，位于剪切位點（Splicing）的最少，占0.01%。

2.2 遺傳多樣性分析

2.2.1 遺傳多樣性度量指標(biāo) 將供試煙草材料按照地理來源劃分為8個群體：加拿大群體、美國群體、福建群體、貴州群體、河南群體、山東群體、四川群體和云南群體，各自包含3、18、2、9、9、11、10、13份材料。由表2可知，各不同地理來源煙草群體的Na為1.27～1.93，平均有1.76個等位基因；He值在0.32～0.59，平均值為0.39；Ho差異較大，范圍在0.22～0.76，平均值為0.33，與He值相差不大；PLN范圍為15 877～44 249，平均值為38 011.38；PPL在26.61～74.17%，平均多態(tài)性位點比率為63.72%；H變化范圍為0.19～0.52，不同地理來源煙草群體的遺傳多樣性差異較大，由高到低依次為山東群體（0.52）、加拿大群體（0.48）、云南群體（0.45）、四川群體（0.43）、美國群體/河南群體（0.41）、貴州群體（0.40）、福建群體（0.19），H平均值為0.41，整體遺傳多樣性較低。其中，云南群體的Na最高，但Ho最低；福建群體的Ho及He最大，而Na、PLN、PPL及H均最低；四川群體的PLN及PPL最高；而遺傳多樣性以山東群體最為豐富。對不同地理來源煙草的樣本數(shù)及遺傳多樣性指標(biāo)進行相關(guān)性分析（表3）發(fā)現(xiàn)，樣本數(shù)與Na、Ho、He等3個遺傳多樣性指標(biāo)呈顯著相關(guān)，并且6個遺傳多樣性指標(biāo)之間均呈顯著相關(guān)關(guān)系。

2.2.2 遺傳距離矩陣 由表4可知，8個不同地理來源煙草群體間的遺傳距離GD值為?0.014 8～ 0.384 9，群體間的遺傳距離不大，供試群體整體的遺傳分化較小，遺傳基礎(chǔ)較為狹窄。河南群體與其他各不同地理來源的群體資源遺傳距離均較近，GD值范圍在0.043 1～0.192 6，說明河南群體與各群體的親緣關(guān)系很近；而福建群體與其他群體遺傳距離均較遠，GD值范圍在0.192 6～0.384 9，其中，福建與貴州群體間的GD系數(shù)最大，表明其遺傳距離最遠，遺傳相似度最低。加拿大群體與云南群體及山東群體的遺傳距離為負值，可能是由于群體內(nèi)的遺傳差異大于群體間的差異所致?？偟膩砜?，遺傳距離與地理來源上的距離并無顯著關(guān)聯(lián)，地理來源間的距離不能單純地判斷種質(zhì)間遺傳距離，只能作為地理距離上的劃分和遺傳距離上判斷的參照。

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 基于遺傳距離的NJ聚類分析 由供試材料的NJ聚類（圖2）來看，基于遺傳距離的聚類分析92份煙草種質(zhì)可以劃分為2個大的類群，各類群又可進一步分為小的亞群?？偟膩砜矗嗤乩韥碓捶N質(zhì)在2個大的類群中存在相對聚合的現(xiàn)象，但在小的亞群中分布較為混雜，相同地理來源的種質(zhì)并未完全歸并到一處。其中，類群I中主要包括了來自福建、山東、河南及未知來源地的煙草資源，而美國、貴州及四川煙草資源主要聚類在類群II中，加拿大和云南煙草資源則在兩個類群中分布較為雜亂。說明了不同地理來源的煙草種質(zhì)資源之間存在一定的地理隔離，但基于遺傳距離的聚類與其地理來源并無必然聯(lián)系。

2.3.2 基于模型的遺傳結(jié)構(gòu)分析 對92份煙草材料進行Structure分析（圖3），假定供試材料的群體數(shù)目（K）為2～8，根據(jù)最大似然值進行最佳K值的估算。當(dāng)K=4時，由ln P（D）求出△K值最大，基于此將供試煙草種質(zhì)劃分為4個亞群，亞群中部分種質(zhì)包含了2或3種遺傳背景，說明亞群間存在一定程度的基因交流。如表5所示，亞群1中包含材料最少，共10份材料，占10.9%；亞群2中材料份數(shù)最多，包括39份，占42.4%；亞群3含13份材料，占14.1%；亞群4占32.6%，包括30份材料。其中，亞群2中包含了全部的福建種質(zhì)，來自美國、加拿大、四川、河南及云南的種質(zhì)大部分劃分在亞群2和亞群4中，而貴州和山東的種質(zhì)則大部分分布在亞群1和亞群2，亞群3包含材料較少并且材料來源較為雜亂。

3 討 論

GBS是一種適用于高多樣性物種的簡便基因分型方法[18-19]，目前應(yīng)用該方法已對玉米[20]、紫花苜蓿[21]、柑橘[22]等物種進行了群體SNP的檢測并用于遺傳圖譜的構(gòu)建、關(guān)聯(lián)分析及遺傳多樣性分析等研究。ZHOU等[20]采用GBS技術(shù)，對314株玉米高世代群體（RILs）進行雙末端PE125低深度測序，基于SNP基因分型結(jié)果，開發(fā)獲得多個bin標(biāo)記并構(gòu)建了玉米高密度遺傳圖譜。YU等[21]利用GBS技術(shù)對179個紫花苜蓿品系進行測序，并結(jié)合表型性狀進行全基因組關(guān)聯(lián)分析，得到10個與黃萎病性狀顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記。王小柯等[22]對240份寬皮柑橘進行GBS測序，基于獲得的高質(zhì)量SNP位點建立的系統(tǒng)演化樹對供試材料進行了準(zhǔn)確的劃分，并且與植物形態(tài)學(xué)的劃分結(jié)果高度吻合。目前GBS技術(shù)在煙草中報道較少，肖炳光等[5]通過基因組簡約法對166個DH株系烤煙測序并結(jié)合生物信息學(xué)分析獲得1015個高質(zhì)量SNP位點，與其他標(biāo)記整合后繪制了高密度烤煙遺傳連鎖圖譜。本研究通過GBS技術(shù)對92個煙草樣本進行測序，產(chǎn)生的高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)量為147.130 Gb，共獲得93 685個高質(zhì)量的SNP位點用于后續(xù)遺傳多樣性分析。

遺傳多樣性是指種內(nèi)不同群體或個體間的遺傳多態(tài)性程度。目前，研究者們利用各種分子標(biāo)記技術(shù)已對煙草種質(zhì)資源的遺傳多樣性與親緣關(guān)系進行了較多探討。MOON等[23]利用70對SSR引物對702份收集來自全球的煙草種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性分析，其Na為2～41個，檢測出的等位基因數(shù)目較多，基因多樣性變化范圍為0.123～0.949，平均0.736，基因的多樣性水平較高，供試煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性極其豐富。張銘真等[24]對81份煙草種質(zhì)材料進行遺傳多樣性分析，Ho平均值為0.354 5，He平均值為0.542 5，H為0.539 1，供試煙草種質(zhì)的遺傳多樣性也相對較為豐富。而FRICANO等[25]利用49個SSR標(biāo)記對源自世界各地的312份煙草種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，Na范圍為3～13個，等位基因數(shù)目相對較少；基因多樣性變化范圍為0.013～0.841，基因的多樣性水平較低，材料間的親緣關(guān)系較近、遺傳背景較為相似；劉艷華等[26]利用SRAP標(biāo)記對81份煙草種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，共擴增出123個多態(tài)性位點，PPL為75.5%，群體內(nèi)H為0.04～0.41，供試材料的遺傳多樣性不高。與MOON等[23]和張銘真等[24]不同，而與FRICANO等[25]和劉艷華等[26]的研究結(jié)果相似，本研究中不同地理來源煙草群體的Na為1.27～1.93，Ho為0.22～0.76，He為0.32～0.59，PPL為26.61%～74.17%，H變化范圍為0.19～0.52。說明本研究供試煙草種質(zhì)的多態(tài)性較高，但等位基因數(shù)較少，整體遺傳多樣性較低。不同地理來源群體間的GD范圍為?0.014 8～0.384 9，供試煙草群體間的遺傳距離較小，說明材料間親緣關(guān)系較近，遺傳基礎(chǔ)較為狹窄，需引入新的種質(zhì)資源以進一步拓寬遺傳多樣性。

利用分子標(biāo)記分析群體遺傳結(jié)構(gòu)的研究中，聚類方法主要有2種：一種是距離聚類法，通過計算兩兩群體（個體）間的遺傳距離，并基于遺傳距離運用NJ或UPGMA算法構(gòu)建聚類圖；另一種是模型聚類法，通過設(shè)置參數(shù)模型運用最大似然法或貝葉斯法等標(biāo)準(zhǔn)算法推斷群體或個體所屬類別，再據(jù)此推斷群體遺傳結(jié)構(gòu)及群體間的親緣關(guān)系[27]。XIA等[28]對我國78份栽培煙草品種進行群體結(jié)構(gòu)預(yù)測，通過UPGMA聚類分析和遺傳結(jié)構(gòu)Structure分析，兩種聚類分析結(jié)果一致，均將供試材料劃分為曬煙和烤煙兩個亞群。童治軍等[29]通過群體遺傳結(jié)構(gòu)分析將231份供試材料劃分成3個亞群，而通過UPGMA進行聚類分析時，基于遺傳距離則將烤煙材料聚為4大類，兩者分類結(jié)果不同。由于兩種聚類分類依據(jù)的不同，作者認(rèn)為根據(jù)Structure軟件劃分為3個群體較為準(zhǔn)確。本研究中基于遺傳距離的NJ聚類分析將92份材料劃分為兩個大的類群，相同地理來源的煙草并未完全聚在一起，這與以往的研究結(jié)果[29-31]相一致，說明煙草種質(zhì)間的遺傳差異并不完全與地理來源相關(guān)?；谀Ｐ偷倪z傳結(jié)構(gòu)分析則將所有材料劃分為4個亞群，與NJ聚類分析結(jié)果有較大差異，這與童治軍等[29]研究結(jié)果相似。為避免人為因素對群體劃分的影響，本研究認(rèn)為基于模型將供試材料分為4個亞群具有較高的準(zhǔn)確性。

4 結(jié) 論

本研究利用GBS技術(shù)對92份煙草種質(zhì)資源進行測序，共產(chǎn)生147.165 Gb測序數(shù)據(jù)，經(jīng)篩選過濾獲得93 685個高質(zhì)量的SNP位點用于遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析。基于模型的遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)供試煙草存在4個亞群結(jié)構(gòu)，亞群間存在一定程度的基因交流；基于遺傳距離的NJ聚類將供試煙草劃分為兩個大的類群，相同地理來源的煙草種質(zhì)在類群劃分中存在相對聚合現(xiàn)象，但群體結(jié)構(gòu)的劃分與種質(zhì)來源不完全相關(guān)；供試材料整體遺傳多樣性偏低，遺傳變異較小。

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