太子參葉斑病病原菌鑒定及防治藥劑篩選

李樹江　周雪林　楊友聯(lián)

摘要

采用形態(tài)學結(jié)合分子系統(tǒng)學方法對引起貴州黃平縣和六枝道地中藥材種植基地太子參葉斑病的病原菌進行鑒定，并以菌絲生長法對75%百菌清可濕性粉劑、70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、37%苯醚甲環(huán)唑可濕性粉劑、40%氟硅唑乳油以及1%申嗪霉素懸浮劑進行了室內(nèi)藥效篩選。結(jié)果表明：引起貴州太子參葉斑病的病原菌為Ascochyta versabilis，該病原菌為太子參病害新記錄；5種殺菌劑除75%百菌清可濕性粉劑2 000倍對A.versabilis的抑菌率較低外（51.4%），其余4種供試殺菌劑均具有較強的抑菌作用。70%甲基硫菌靈可濕性粉劑2 000倍、37%苯醚甲環(huán)唑可濕性粉劑2 000倍和40%氟硅唑乳油2 000倍對A.versabilis的生長具有較強的抑制作用，其抑制率均高于90%；1%申嗪霉素懸浮劑2 000倍對該病原菌的抑制率為72.3%。

關鍵詞

太子參； Ascochyta versabilis； 分子系統(tǒng)學； 藥劑篩選

中圖分類號：

S 435.67

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017284

Pathogen identification of leaf spot on Pseudostellaria heterophylla and

screening of fungicides for its control

LI Shujiang， ZHOU Xuelin， YANG Youlian

（School of Biological Sciences and Technology， Liupanshui Normal University， Liupanshui 553004， China）

Abstract

Based on morphological characteristics and ITS phylogeny analysis， the pathogen caused leaf spot on Pseudostellaria heterophylla was isolated and identified from Liuzhi and Huangping， Guizhou Province. The inhibition effects of chlorothalonil 75% WP， thiophanatemethyl 70% WP， difenoconazole 37% WP， flusilazole 40% EC， phenazino1carboxylic acid 1% SC on the pathogen of leaf spot were tested by mycelial growth method in laboratory. The results indicated that the pathogen was identified to be Ascochyta versabilis. Among the five fungicides， chlorothalonil 75% WP （2 000×） showed lower inhibition rates （51.4%） against A.versabilis， while the other four fungicides had good control efficacies， with the inhibition rates of more than 90% for difenoconazole 37% WP （2 000×）， thiophanatemethyl 70% WP （2 000×） and flusilazole 40% EC （2 000×）， and 72.3% for phenazino1carboxylic acid 1% SC （2 000×）， respectively.

Key words

Pseudostellaria heterophylla； Ascochyta versabilis； molecular phylogeny； screening of fungicides

太子參Pseudostellaria heterophylla （Miq.） Pax為石竹科孩兒參屬植物，又名孩兒參、異葉假繁縷，含有環(huán)肽類、氨基酸、皂苷類、糖類、醛類、醇類、脂類、微量元素、類黃酮等化學成分。太子參為一種名貴中藥材，以塊根入藥，具有益氣健脾、生津潤肺之功效[1]。目前，太子參野生資源已經(jīng)非常稀缺，市售太子參主要來自人工栽培。安徽、江蘇、福建、貴州為全國四大栽培主產(chǎn)區(qū)[23]，其中貴州黔東南州太子參栽培面積達1.39萬hm2[3]，主要集中在施秉縣和黃平縣。

由于市場對太子參需求的增加，太子參人工種植區(qū)域及面積逐年擴大[4]，真菌病害的危害日益凸顯，嚴重影響了太子參的產(chǎn)量和品質(zhì)[46]。葉斑病是太子參主要真菌病害之一，貴州種植區(qū)域內(nèi)的太子參都有葉斑病發(fā)生，一般情況下病株率0.1%～15%，嚴重時病株率達70%以上，產(chǎn)量損失達50%以上[7]。本研究對引起貴州六枝特區(qū)道地中藥材種植基地和黃平縣種植基地太子參真菌病害的病原菌進行分離鑒定， 并進行了室內(nèi)防治藥劑篩選，旨在為太子參葉斑病的病原識別及有效防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病原標本采集與分離

2012年8月和2013年8月分別從六枝特區(qū)道地中藥材種植基地和黃平縣一碗水鄉(xiāng)太子參種植基地采集具有真菌感染特征的葉片（圖1a），裝入信封帶回實驗室，采用水瓊脂培養(yǎng)基（WA）和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）以單胞分離法[8]分離病原菌，分離菌株4℃斜面保存。

1.2 病原菌的鑒定

1.2.1 形態(tài)學鑒定

在體視顯微鏡下挑取病斑上的分生孢子器觀察孢子及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征。用直徑為5 mm的打孔器從PDA培養(yǎng)基25℃活化5 d的平板菌落邊緣打取菌餅，移至新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每株菌株接5皿，在25℃下12 h黑光燈12 h黑暗交替培養(yǎng)。7 d后采取十字交叉法測定菌株生長速率、觀察菌落及分生孢子等特征。

1.2.2 分子系統(tǒng)學分析

1.2.2.1 菌絲體收集、DNA提取及ITS擴增與測序

將供試菌株分別接種于PDA平板上，25℃恒溫培養(yǎng)14 d，用無菌刀刮取菌絲體置于1.5 mL無菌離心管中，參考Chen等的方法提取基因組DNA[9]，并電泳檢測。采用引物ITS1/ITS4 （CCGTAGGTGAACCTGCGG/TCCTCCGCTTATTGATATGC）對rDNA的ITS序列進行擴增，擴增產(chǎn)物送往北京諾賽基因有限公司測序。

1.2.2.2 ITS分子系統(tǒng)學分析

采用Clustal X 2.0.10對測得的ITS序列以及從GenBank下載的相關序列進行比對（圖2）。為實現(xiàn)排序匹配的最優(yōu)化，再用Bioedit 5.0.6軟件手工校正。比對后的序列采用PAUP* 4.0 Beta 10軟件以最大簡約法（maximum parsimony， MP）進行分析，以啟發(fā)式搜索法（heuristic search）獲取系統(tǒng)發(fā)育樹。其中，啟發(fā)式搜索采用二等分再連接法（treebisectionreconnection， TBR）作為獲取聚類樹的方法。系統(tǒng)發(fā)育樹的各個分支的支持強度通過1 000次重復的自展檢驗數(shù)值進行評估。

1.3 室內(nèi)藥效試驗

供試藥劑為75%百菌清WP，先正達蘇州作物保護有限公司；70%甲基硫菌靈WP，上海滬聯(lián)生物藥企業(yè)有限公司；37%苯醚甲環(huán)唑WP，瑞士先正達作物有限公司；40%氟硅唑EC，上海科捷佳實業(yè)有限公司和1%申嗪霉素SC，上海農(nóng)樂生物制品股份有限公司。

用約60℃的無菌PDA培養(yǎng)基將各藥劑稀釋2 000倍，制成含殺菌劑的PDA培養(yǎng)基備用。

采用生長速率法測定不同藥劑對病原菌生長的影響。在含殺菌劑的PDA培養(yǎng)基中接入活化好的供試菌株菌餅（d=5 mm），置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，14 d后用“十字交叉法”測量菌落直徑，用以下公式計算抑菌率[10]。每種藥劑設4個重復，以無菌水作為對照。

抑菌率=對照菌落直徑-處理菌落直徑對照菌落直徑-5×100%。

抑菌率以 SPSS 22.0 軟件，采用Oneway ANOVA test方法通過 Duncans檢驗分析各藥劑處理之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 病癥特征及病原菌分離

太子參感病后，初期葉片上出現(xiàn)近圓形病斑，水漬狀，隨后病斑增大并變成黃褐色枯斑，由內(nèi)向外逐漸形成由分生孢子器形成的明顯黑色輪紋（圖1a）。采用單孢分離法共分離到5株病原菌，其中從六枝特區(qū)道地中藥材種植基地分離到3株：LPSU2012200、LPSU2012201、LPSU2012202；從黃平縣分離到2株：LPSU2013231、LPSU2013232。

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)學特征

病原菌產(chǎn)生的分生孢子器在寄主葉片表皮下著生，黑色，隨著孢子成熟，分生孢子器突破表皮明顯隆起，具孔口（圖1b～c）；分生孢子單孢，無色，短柱狀或長橢圓形，偶略彎曲，兩端鈍圓，中部偶有縊縮，無色；大?。?.5～12）μm×（3～5.5）μm，平均（9.7±1.5）μm×（4.3±0.6）μm（n=50）（圖1f）。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d后，菌落正面絨毛狀，圓形，墨綠色，邊緣近白色略灰，緊貼培養(yǎng)基生長；反面墨綠色，圓形，邊緣一圈白色略灰（圖1d～e）。菌落平均直徑3.3 cm，平均生長速度0.47 cm/d。在PDA上純培養(yǎng)未見孢子形成。

2.2.2 分子系統(tǒng)學鑒定

結(jié)合純培養(yǎng)菌落和顯微形態(tài)特征，分離的5株菌株為同一病原菌，選擇2株代表性菌株進行分子系統(tǒng)學分析。所選菌株ITS在GenBank的登錄號為MF577046、MF577047。以PAUP*4.0 Beta 10軟件構(gòu)建的代表性菌株及相關序列的最大簡約樹如圖2所示。從系統(tǒng)樹可看出，供試菌株LPSU2012202和LPSU2012201與Ascochyta versabilis （GU237913和GU237909）聚成一簇，支持率為88%。

根據(jù)病原菌形態(tài)學特征和ITS分子系統(tǒng)學分析，引起黃平縣及六枝太子參葉斑病的病原菌為Ascochyta versabilis （Boerema et al.） Q. Chen & L. Cai， comb[11]。

2.3 不同殺菌劑對太子參葉斑病病原菌的抑制作用

參照1.3抑菌率的計算公式，得出各藥劑的抑菌情況（表1）。從表1可見， 供試的5種殺菌劑對病原菌均具有抑制作用，其中70%甲基硫菌靈WP （2 000×）、40%氟硅唑EC（2 000×）和37%苯醚甲環(huán)唑WP（2 000×）對病原菌的生長抑制作用最強，其抑制率均為94%，這三種藥劑與其他2種藥劑抑菌率有顯著差異（P<0.05）；75%百菌清WP（2 000×）的抑菌效果最差，抑菌率為51.4%。

3 討論

3.1 引起太子參葉部病害的真菌種類

據(jù)報道，國內(nèi)太子參葉部病害主要有由茄匐柄霉Stemphylium solani G. F. Weber引起的褐斑病[1213]，立枯絲核菌Rhizoctonia solani J.G. Kühn和互隔文鏈格孢Alternaria alternata Fr. Keissl.引起的立枯病[1213]，某種殼針孢屬真菌Septoria sp.[56，1415]、某種莖點霉屬真菌Phoma sp.[1617]和葉點霉屬的Phyllosticta commonsii Ellis & Everh.[18]引起的葉斑病，Peronospora parasitica （Pers.） Fr.引起的霜霉病[6，19]以及Melampsorella caryophyllacearum （DC.） J. Schrt.引起的銹病[20]。由此可見，本研究分離鑒定的Ascochyta versabilis為太子參病害新記錄，在今后的種植中應加強防治。

Ascochyta versabilis為2015年根據(jù)分子系統(tǒng)學分析結(jié)合形態(tài)學特征發(fā)表的新組合種，其基本異名為Phoma versabilis Boerema， Loer. & Hamers[11]。在形態(tài)上，Ascochyta與Phoma真菌較難區(qū)分，尤其Ascochyta中的單孢種類形態(tài)及大小常與莖點霉屬部分種類相互重疊。王宗華、溫學森等根據(jù)形態(tài)學研究認為引起我國福建、山東太子參葉斑點病的病原菌為莖點霉屬真菌Phoma sp.[1617]，其具體分類地位有待于進一步的研究。

3.2 太子參病原菌Ascochyta versabilis的防治

通過對5種殺菌劑抑菌試驗結(jié)果表明，70%甲基硫菌靈WP、37%苯醚甲環(huán)唑WP和40%氟硅唑EC對太子參病原菌Ascochyta versabilis的抑制作用較好，抑制率均達90%以上，但是這3種殺菌劑毒性相對較大，易引起農(nóng)藥殘留問題。1%申嗪霉素SC雖然防治效果次之（抑菌率72.3%），但該藥為生物源抗生素，具有毒性較低、半衰期短等特點[2122]，故建議防治Ascochyta versabilis引起的太子參葉斑病應以申嗪霉素為主，尤其是在接近采收期時，以降低農(nóng)藥殘留，提高安全性。

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（責任編輯：楊明麗）