• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    抗芐嘧磺隆野慈姑乙酰乳酸合成酶的突變研究

    2018-05-14 12:17:24付丹妮趙鉑錘孫中華紀(jì)明山
    植物保護(hù) 2018年3期
    關(guān)鍵詞:慈姑磺隆抗藥性

    付丹妮 趙鉑錘 孫中華 紀(jì)明山

    摘要

    近年來,野慈姑Sagittaria trifolia L.在中國東北稻區(qū)發(fā)生和危害日趨嚴(yán)重,部分稻區(qū)使用芐嘧磺隆已無法有效防除該雜草。為了明確野慈姑抗藥性發(fā)生的根本原因,本試驗(yàn)從分子水平上對(duì)野慈姑抗芐嘧磺隆的機(jī)理進(jìn)行了研究。通過對(duì)抗藥性(H4)和敏感性(S)野慈姑種群靶標(biāo)酶乙酰乳酸合成酶(ALS)基因片段進(jìn)行擴(kuò)增和克隆,比較其DNA序列的差異,確定導(dǎo)致抗藥性產(chǎn)生的ALS氨基酸突變位點(diǎn)。結(jié)果表明,與敏感性野慈姑ALS基因相比,H4種群第197位脯氨酸(Pro)突變?yōu)樘K氨酸(Thr),該位點(diǎn)的突變可能是H4野慈姑種群對(duì)芐嘧磺隆產(chǎn)生抗藥性的主要原因。ALS第197位Pro突變?yōu)門hr致使對(duì)芐嘧磺隆產(chǎn)生抗藥性是第一次在野慈姑種群中報(bào)道。

    關(guān)鍵詞

    水稻田; 野慈姑; 靶標(biāo)抗藥性

    中圖分類號(hào):

    S 481.4

    文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A

    DOI: 10.16688/j.zwbh.2017232

    Mutation in acetolactate synthase of Sagittaria trifolia resistant tobensulfuronmethyl

    FU Danni, ZHAO Bochui, SUN Zhonghua, JI Mingshan

    (College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

    Abstract

    In recent years, Sagittaria trifolia L. has been a serious problem in paddy fields in northeast of China. It is very difficult to control by bensulfuronmethyl in some areas. The objective of this study is to understand the molecular mechanism of the resistance to bensulfuronmethyl in S.trifolia and to find the specific mutation sites in amino acid sequence of acetolactate synthase (ALS) in the resistant S.trifolia populations.Fragments encoding the ALS were amplified and cloned from susceptible (S) and resistant (H4) S.trifolia populations to bensulfuronmethyl, respectively, and sequenced subsequently.Sequence analysis showed that H4 population had a mutation at position 197(Pro). The mutation was Pro197Thr,which may be responsible for the resistance to bensulfuronmethyl in the S.trifolia population.Pro197Thr mutation conferring resistance to bensulfuronmethyl is reported for the first time in S.trifolia.

    Key words

    paddy field; Sagittaria trifolia; targetsite resistance (TSR)

    野慈姑Sagittaria trifolia L.,澤瀉科慈姑屬多年生水生或沼生草本植物,主要分布于熱帶以及亞洲的溫帶地區(qū)[1],是水稻田常見的闊葉雜草之一,以球莖進(jìn)行營養(yǎng)繁殖為主。芐嘧磺?。╞ensulfuronmethyl)屬磺酰脲類除草劑,通過抑制植物體內(nèi)的乙酰乳酸合成酶ALS酶活性,阻止支鏈氨基酸的合成,從而導(dǎo)致植物蛋白質(zhì)合成受損,最終殺死植物[23]。自20世紀(jì)80年代中后期,由于芐嘧磺隆具有活性高、選擇性強(qiáng)、毒性低等特點(diǎn),在我國東北水稻產(chǎn)區(qū)開始廣泛使用,使野慈姑得到了有效防治。而由于芐嘧磺隆作用位點(diǎn)單一和大量連續(xù)使用,導(dǎo)致了抗芐嘧磺隆的野慈姑大量出現(xiàn)。2000年前后,芐嘧磺隆對(duì)野慈姑的防效明顯下降,野慈姑的發(fā)生和危害日趨嚴(yán)重[4],相繼在吉林省[5]和遼寧省[6]發(fā)現(xiàn)了抗磺酰脲類除草劑的野慈姑種群。

    在大多數(shù)情況下,雜草對(duì)ALS抑制劑產(chǎn)生抗藥性是由ALS基因一個(gè)或幾個(gè)位點(diǎn)突變所引起[7]。目前,在抗ALS抑制劑的雜草中,靶標(biāo)酶上已發(fā)現(xiàn)有8個(gè)突變位點(diǎn)(Alal22,Prol97,Ala205,Asp376,Arg377,Trp574,Ser653,Gly654)發(fā)生28種氨基酸替換,其中任何一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變,均可大幅度降低除草劑品種與雜草靶標(biāo)的親和力[810]。Guttieri等[11]在1992年報(bào)道了毒萵苣Lactuca seriola和地膚Kochia scoparia對(duì)ALS抑制劑的抗性是由197位脯氨酸突變所引起,首次從分子水平上研究了雜草抗藥性機(jī)理。隨著研究技術(shù)的發(fā)展,更多雜草的ALS基因被克隆、測序、分析,抗藥性機(jī)理得到更好的解釋。

    我國東北地區(qū)使用芐嘧磺隆防治水稻田雜草具有較早的歷史,根據(jù)田間調(diào)查和農(nóng)民的反映,大多數(shù)稻田的野慈姑已經(jīng)對(duì)芐嘧磺隆產(chǎn)生了抗藥性。研究野慈姑對(duì)芐嘧磺隆的抗藥性問題,對(duì)抗藥性野慈姑的治理以及指導(dǎo)農(nóng)民正確使用除草劑具有重要意義。本研究從分子水平上確定野慈姑對(duì)芐嘧磺隆的抗藥性是由于ALS基因突變所引起,并初步明確其產(chǎn)生抗藥性突變的基因位點(diǎn)。為延緩野慈姑抗藥性種群的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    抗藥性野慈姑球莖(H4)于2015年5月采自黑龍江省雙鴨山市寶清縣方盛村多年連續(xù)使用磺酰脲類除草劑芐嘧磺隆的稻田,野慈姑已對(duì)芐嘧磺隆產(chǎn)生抗藥性。將采集的球莖種植于無孔的塑料花盆內(nèi)(23 cm×15 cm),置于室外正常水分管理,待其長至2~3葉期用30%芐嘧磺隆可濕性粉劑(上海杜邦農(nóng)化有限公司)120 g/hm2莖葉噴霧處理,處理后存活的植株繼續(xù)培養(yǎng)。

    對(duì)照敏感性野慈姑幼苗(S)于2015年6月采自遼寧省沈陽市棋盤山風(fēng)景區(qū)遠(yuǎn)離稻田的湖邊(未使用過除草劑)。將采集的幼苗種植于無孔的塑料花盆內(nèi)(23 cm×15 cm),置于室外正常水分管理。隨機(jī)挑選20株用30%芐嘧磺隆可濕性粉劑30 g/hm2莖葉噴霧處理,21 d后全部死亡,未處理植株繼續(xù)培養(yǎng)。2015年11月上旬從花盆中挖出抗藥性和敏感性球莖分別保存于4℃冰箱中,待用。

    取冰箱中保存的大小一致的抗藥性(H4)和敏感性(S)野慈姑球莖分別放置于裝有清水的培養(yǎng)皿中,在28℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)催芽3 d后,每盆3個(gè)球莖,分別種植于無孔的塑料盆內(nèi)(23 cm×15 cm)。種植深度3 cm,保持水層3~5 cm。試驗(yàn)用土為未使用過除草劑的稻田土。放置于溫室中,生長條件為白天(25±5)℃,夜間(14±5)℃。待植株長至3~4葉期,取幼嫩葉片,放入-80℃冰箱中保存,待用。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 野慈姑DNA的提取

    用Tiangen生化科技(北京)有限公司的DNAsecure Plant Kit提取抗藥性(H4)和敏感性(S)野慈姑的DNA,各取10個(gè)葉片進(jìn)行提取。用紫外分光光度計(jì)法檢測DNA的濃度和純度。用OD260/OD280衡量DNA純度,比值大于1.9,表明有RNA污染;小于1.6,表明有蛋白質(zhì)、酚等污染。

    1.2.2 野慈姑ALS基因片段的擴(kuò)增和克隆

    用表1所列兩對(duì)引物分別擴(kuò)增H4和S野慈姑DNA,產(chǎn)物包含已報(bào)道的8個(gè)突變位點(diǎn)。25 μL的PCR反應(yīng)體系中包括:葉片總DNA(60 ng/μL)1.0 μL,上游和下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL,2×Es TaqMasterMix(Dye)12.5 μL,ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min,然后94℃變性30 s,在每個(gè)引物的最佳退火溫度下退火30 s(表1),72℃延伸90 s,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

    PCR反應(yīng)結(jié)束后,取5 μL產(chǎn)物,用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用生工生物工程(上海)股份有限公司SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化,將回收片段與pUCT載體連接,然后轉(zhuǎn)到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中,均勻涂布于含有Xgal/IPTG的氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜,選擇白色菌落挑至含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基,振蕩培養(yǎng)過夜,用生工生物工程(上海)股份有限公司SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒按上述PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增,并進(jìn)行電泳檢測,出現(xiàn)目的片段的為陽性克隆。

    1.2.3 測序及序列分析

    陽性克隆的序列測定采用美國ABI公司的3730XL測序儀和雙脫氧鏈終止法進(jìn)行,由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。每個(gè)種群選取10株單個(gè)植株用做突變檢測,每個(gè)片段測序5個(gè)陽性克隆。將測序的序列進(jìn)行BLASTx比對(duì),然后用DNAMAN 8.0對(duì)抗藥性和敏感性野慈姑ALS基因片段序列進(jìn)行比對(duì)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 ALS基因片段的擴(kuò)增與克隆

    提取的野慈姑H4和S種群的DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測,OD260/OD280在1.7~1.9范圍內(nèi),表明DNA的純度達(dá)到了要求。用兩對(duì)引物擴(kuò)增野慈姑不同種群的DNA,分別得到大約920 bp和730 bp的片段(圖1)。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收后的產(chǎn)物與pUCT載體連接、轉(zhuǎn)化,對(duì)重組的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定,獲得的片段與最初的兩個(gè)PCR產(chǎn)物大小相同。

    2.2 ALS基因片段測定結(jié)果

    用DNAMAN 8.0將測序后的兩段序列拼接,得到的序列總長度為1 634 bp,編碼547個(gè)氨基酸,在NCBI中進(jìn)行BLAST,與已經(jīng)登記的野慈姑ALS基因序列同源性達(dá)到99%,證明擴(kuò)增得到的野慈姑ALS基因序列是正確的。這段序列中不存在內(nèi)含子,并且包含了在其他雜草中已經(jīng)報(bào)道的8個(gè)氨基酸突變位點(diǎn)。將得到的抗藥性和敏感性野慈姑ALS基因片段和擬南芥ALS基因片段用DNAMAN 8.0進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果(表2)顯示,與敏感性野慈姑種群S相比,抗藥性種群H4在第197位脯氨酸都發(fā)生了突變,此位點(diǎn)由CCC突變成ACC(圖2),編碼蘇氨酸(Thr),所測得的10個(gè)植株在Pro197位都有相同的突變,在已經(jīng)報(bào)道的Ala122、Ala205、Asp376、Arg377、Trp574、Ser653、Gly654位點(diǎn)均沒有產(chǎn)生突變。

    3 結(jié)論與討論

    目前,被研制開發(fā)出來的不同結(jié)構(gòu)的ALS抑制劑類除草劑最主要有五大類,即磺酰脲類(sulfonylurea, SU)、咪唑啉酮類(imidazolinone, IMI)、嘧啶硫代苯甲酸酯類(pyrimidinylthiobenzoate, PTB)、三唑并嘧啶類(triazolopyrimidine, TP)和磺酰胺羰基三唑啉酮類(sulfonylaminocarbonyltriazolinone, SCT),其中磺酰脲類、三唑并嘧啶類和咪唑啉酮類品種多,被廣泛推廣和應(yīng)用[1215]。由于該類除草劑作用位點(diǎn)單一和大量的重復(fù)使用,抗該類除草劑雜草大量出現(xiàn)[16]。截至目前,世界各地已有159種雜草對(duì)ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生了抗藥性[17]。

    國內(nèi)外有關(guān)野慈姑對(duì)ALS抑制劑類除草劑抗性機(jī)制的研究主要集中在高水平抗性的靶標(biāo)位點(diǎn)突變上。Iwakami等[18]研究發(fā)現(xiàn),日本秋田縣野慈姑R1和R2兩個(gè)種群對(duì)磺酰脲類除草劑產(chǎn)生了抗藥性,R1和R2對(duì)芐嘧磺隆及R1對(duì)吡嘧磺隆均表現(xiàn)高抗,其中抗藥性野慈姑種群R1與敏感性種群S1相比,ALS基因第197位氨基酸由脯氨酸(CCC)突變?yōu)榻z氨酸(TCC),屬于靶標(biāo)抗藥性(targetsite resistance, TSR)。Wei等[6]測定了東北地區(qū)兩個(gè)水稻田野慈姑種群對(duì)芐嘧磺隆的抗藥性水平,并通過與敏感種群ALS基因序列進(jìn)行比較,確定ALS基因Pro197Leu和Pro197Ser突變引起抗藥性野慈姑ALS對(duì)該藥劑的敏感性降低,是引起其產(chǎn)生抗藥性的原因。

    本研究通過對(duì)抗藥性及敏感性野慈姑ALS基因進(jìn)行擴(kuò)增、測序和對(duì)比后發(fā)現(xiàn),抗藥性H4野慈姑種群的ALS基因第197位脯氨酸(Pro)被蘇氨酸(Thr)取代,這是第一次在野慈姑種群中被發(fā)現(xiàn)。ALS基因Pro197Thr取代導(dǎo)致雜草對(duì)ALS抑制劑類除草劑產(chǎn)生抗藥性在前人的研究中已得到證實(shí)。例如: 野蘿卜Raphanus raphanistrum L.、螢藺Scirpus juncoides (Roxb.)、播娘蒿Descurainia sophia L.和看麥娘Alopecurus aequalis Sobol.等,該突變是其對(duì)磺酰脲類除草劑產(chǎn)生抗藥性的分子基礎(chǔ)[1922]。因此,Pro197Thr是導(dǎo)致H4野慈姑種群對(duì)芐嘧磺隆產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。

    參考文獻(xiàn)

    [1] 汪小凡,陳家寬. 野慈姑自然群體異交率的定量估測[J].遺傳, 2000, 22(5): 316318.

    [2] DUGGLEBY R G, MCCOURT J A, GUDDAT L W. Structure and mechanism of inhibition of plant acetohydroxyacid synthase [J].Plant Physiology and Biochemistry, 2008, 46(3): 309324.

    [3] DUGGLEBY R G, PANG S S.Acetohydroxyacid synthase [J].BMB Reports, 2000, 33(1): 136.

    [4] 陳麗麗,何付麗,范丹丹,等.黑龍江省野慈姑對(duì)吡嘧磺隆的敏感性測定[J].植物保護(hù),2013,39(6):120123.

    [5] 吳明根,曹鳳秋,杜小軍,等.延邊地區(qū)稻田抗藥性雜草的研究[J].雜草科學(xué),2005(1):1415.

    [6] WEI Songhong, LI Pingsheng, JI Mingshan, et al. Targetsite resistance to bensulfuronmethyl in Sagittaria trifolia L. populations[J]. Pesticide Biochemistry and Physiology, 2015, 124: 8185.

    [7] 張朝賢, 倪漢文, 魏守輝, 等. 雜草抗藥性研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(4): 12741289.

    [8] CUI Hailan, ZHANG Chaoxian, ZHANG Hongjun, et al. Confirmation of flixweed (Descurainia sophia) resistance to tribenuron in China [J]. Weed Science, 2008, 56(6): 775779.

    [9] YU Q, POWLES S B. Resistance to AHAS inhibitor herbicides: current understanding[J]. Pest Management Science, 2014, 70(9): 13401350.

    [10]VARANASI V K, GODAR A S, PETERSON D E,et al. A targetsite point mutation in henbit (Lamium amplexicaule) confers highlevel resistance to ALSinhibitors[J]. Weed Science, 2016, 64(2): 231239.

    [11]GUTTIERI M J, EBERLEIN C V, THILL D C. Diverse mutations in the acetolactate synthase gene confer chlorsulfuron resistance in kochia (Kochia scoparia) biotypes [J].Weed Science,1995,43(2):175178.

    [12]CHALEFF R S, MAUVAIS C J.Acetolactate synthase is the site of action of two sulfonylurea herbicides in higher plants[J]. Science, 1984, 224: 14431446.

    [13]SHANER D L, ANDERSON P C, STIDHAM M A.Imidazolinones: Potent inhibitors of acetohydroxydacid synthase[J]. Plant Physiology,1984, 76(2): 545546.

    [14]GERWICK B C, Subramanian M V, LoneyGallant V I, et al. Mechanism of action of the 1,2, 4triazolo [1, 5α] pyrimidines[J]. Pest Management Science, 1990, 29(3): 357364.

    [15]STIDHAM M A. Herbicides that inhibit acetohydroxyacid synthase [J]. Weed Science, 1991, 39(3): 428434.

    [16]盧宗志, 張朝賢, 傅俊范, 等. 抗芐嘧磺隆雨久花ALS基因突變研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(10): 35163521.

    猜你喜歡
    慈姑磺隆抗藥性
    咸菜慈姑湯
    SDF5 Encoding P450 Protein Is Required for Internode Elongation in Rice
    Rice Science(2021年4期)2021-07-13 10:00:54
    75%醚苯磺隆水分散粒劑的制備
    澳大利亞谷物害蟲抗藥性不斷增加的原因和管理
    莘縣地區(qū)灰霉病菌對(duì)腐霉利的抗藥性研究
    植物有害生物抗藥性及治理對(duì)策
    稻田雜草野慈姑的發(fā)生與防治
    慈姑多糖的提取工藝及其抗腫瘤活性
    中成藥(2016年8期)2016-05-17 06:08:37
    10%芐嘧磺隆·異丙草胺可濕性粉劑對(duì)水稻拋秧田雜草的防除作用
    我國冬小麥區(qū)菵草種群對(duì)甲基二磺隆的抗性水平
    99久久综合免费| 日日啪夜夜爽| 午夜91福利影院| 高清不卡的av网站| 久久97久久精品| 2021少妇久久久久久久久久久| 婷婷色综合www| 老司机亚洲免费影院| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 下体分泌物呈黄色| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲图色成人| 一区二区日韩欧美中文字幕| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产成人精品在线电影| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 人人妻人人澡人人看| 精品一区二区免费观看| 亚洲av男天堂| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 看免费av毛片| 国产精品嫩草影院av在线观看| 欧美日韩av久久| 久久久久久久国产电影| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 韩国av在线不卡| 午夜av观看不卡| 国产毛片在线视频| 亚洲国产欧美网| bbb黄色大片| 宅男免费午夜| 天美传媒精品一区二区| 男女无遮挡免费网站观看| 国产精品久久久久久精品电影小说| 黑人欧美特级aaaaaa片| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 久久亚洲国产成人精品v| 中国国产av一级| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 在线观看人妻少妇| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产精品无大码| 男女高潮啪啪啪动态图| 一二三四在线观看免费中文在| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 美女高潮到喷水免费观看| 高清视频免费观看一区二区| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产视频首页在线观看| 五月天丁香电影| 日日啪夜夜爽| 老司机影院毛片| 日韩一本色道免费dvd| 爱豆传媒免费全集在线观看| www日本在线高清视频| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产成人精品福利久久| e午夜精品久久久久久久| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 如何舔出高潮| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 精品人妻在线不人妻| 午夜日韩欧美国产| 国产成人欧美在线观看 | 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产av一区二区精品久久| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲精品,欧美精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲第一av免费看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 免费av中文字幕在线| 久久久久精品国产欧美久久久 | 亚洲一区中文字幕在线| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 一级a爱视频在线免费观看| 十八禁高潮呻吟视频| 久久久国产精品麻豆| 中文字幕人妻熟女乱码| av天堂久久9| 久久久精品区二区三区| 精品国产一区二区三区四区第35| 久久精品国产a三级三级三级| av天堂久久9| 国产探花极品一区二区| 美女国产高潮福利片在线看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲国产欧美一区二区综合| 中文欧美无线码| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲五月色婷婷综合| 免费看不卡的av| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 国产一区二区在线观看av| av.在线天堂| 搡老岳熟女国产| 一个人免费看片子| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产精品无大码| 国产成人免费无遮挡视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 中文欧美无线码| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 日韩一区二区三区影片| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲精品第二区| 色婷婷av一区二区三区视频| 国产伦人伦偷精品视频| 国产精品国产av在线观看| 亚洲图色成人| 午夜福利视频在线观看免费| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 日本色播在线视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 九草在线视频观看| 日本黄色日本黄色录像| 在线精品无人区一区二区三| 国产精品蜜桃在线观看| 大码成人一级视频| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产熟女欧美一区二区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 久久性视频一级片| 免费高清在线观看日韩| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 中文字幕制服av| 亚洲欧美一区二区三区国产| 一级毛片我不卡| 久久99热这里只频精品6学生| 老司机亚洲免费影院| 一个人免费看片子| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| netflix在线观看网站| 搡老乐熟女国产| 哪个播放器可以免费观看大片| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲美女视频黄频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产人伦9x9x在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 黑丝袜美女国产一区| 欧美av亚洲av综合av国产av | 久久久久久久国产电影| 久久久欧美国产精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 十八禁高潮呻吟视频| 亚洲av福利一区| 黄色视频不卡| 国产视频首页在线观看| 成人免费观看视频高清| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲精品日本国产第一区| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久精品久久久久久久性| 色吧在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美日韩综合久久久久久| 高清黄色对白视频在线免费看| 18禁动态无遮挡网站| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产精品免费大片| 国产成人啪精品午夜网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 狂野欧美激情性bbbbbb| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 精品一区二区免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 伦理电影免费视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 狂野欧美激情性bbbbbb| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| av视频免费观看在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 久久女婷五月综合色啪小说| www.精华液| 亚洲成人一二三区av| 波野结衣二区三区在线| 两个人看的免费小视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 51午夜福利影视在线观看| 日韩一区二区三区影片| 亚洲美女搞黄在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 日日啪夜夜爽| 黄色 视频免费看| 下体分泌物呈黄色| 好男人视频免费观看在线| 亚洲成色77777| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 人成视频在线观看免费观看| 天堂8中文在线网| 亚洲国产精品国产精品| 91国产中文字幕| 99九九在线精品视频| 制服人妻中文乱码| av又黄又爽大尺度在线免费看| 夫妻午夜视频| 最近中文字幕高清免费大全6| 看免费av毛片| 黄色毛片三级朝国网站| 欧美人与性动交α欧美软件| 国产精品99久久99久久久不卡 | 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 日本av免费视频播放| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产精品蜜桃在线观看| 免费在线观看完整版高清| 国产男女超爽视频在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 超碰97精品在线观看| 一区二区三区激情视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 啦啦啦啦在线视频资源| 91成人精品电影| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 色播在线永久视频| 国产欧美亚洲国产| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲色图综合在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产成人a∨麻豆精品| 久久综合国产亚洲精品| 精品少妇久久久久久888优播| 精品一区二区免费观看| 夫妻午夜视频| 国产深夜福利视频在线观看| 十八禁人妻一区二区| 久久99热这里只频精品6学生| 99热全是精品| 老熟女久久久| 日日摸夜夜添夜夜爱| 成人漫画全彩无遮挡| 国产精品欧美亚洲77777| 在线观看免费高清a一片| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美精品一区二区大全| 精品少妇久久久久久888优播| 秋霞在线观看毛片| 乱人伦中国视频| 久久热在线av| 色综合欧美亚洲国产小说| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99久久精品国产亚洲精品| 精品一区在线观看国产| 午夜精品国产一区二区电影| 丝袜人妻中文字幕| 欧美人与性动交α欧美软件| 免费少妇av软件| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 婷婷色麻豆天堂久久| 男女床上黄色一级片免费看| 美女视频免费永久观看网站| 男人爽女人下面视频在线观看| www.自偷自拍.com| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一级毛片 在线播放| 超碰成人久久| 久久久久久久国产电影| av不卡在线播放| 国产高清国产精品国产三级| 国产视频首页在线观看| 色视频在线一区二区三区| 少妇 在线观看| 波野结衣二区三区在线| 久久久久人妻精品一区果冻| 999久久久国产精品视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产成人一区二区在线| 亚洲第一青青草原| 国产成人系列免费观看| 国产精品久久久久成人av| 国产一区二区 视频在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产男人的电影天堂91| 男女边吃奶边做爰视频| 国产精品久久久久成人av| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲国产av影院在线观看| 久久精品国产综合久久久| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲av在线观看美女高潮| 一区二区三区激情视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 中文字幕精品免费在线观看视频| netflix在线观看网站| 国产精品久久久久久精品古装| 国产又色又爽无遮挡免| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 无遮挡黄片免费观看| 国产极品天堂在线| netflix在线观看网站| av在线老鸭窝| 99热网站在线观看| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 免费观看人在逋| 亚洲熟女精品中文字幕| 极品人妻少妇av视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲国产av影院在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 国产av精品麻豆| 国产成人精品久久久久久| 国产精品免费大片| 男人添女人高潮全过程视频| 久久久国产一区二区| 久久久久久久国产电影| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 咕卡用的链子| 欧美日韩精品网址| 99久久99久久久精品蜜桃| 99久久精品国产亚洲精品| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 一二三四在线观看免费中文在| 大香蕉久久网| 男男h啪啪无遮挡| 99国产精品免费福利视频| 亚洲国产欧美在线一区| 老汉色∧v一级毛片| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲天堂av无毛| 国产极品粉嫩免费观看在线| av免费观看日本| 桃花免费在线播放| 国产片内射在线| 国产片特级美女逼逼视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 中国三级夫妇交换| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 免费在线观看黄色视频的| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美人与善性xxx| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 一级毛片电影观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 一本久久精品| 久久久国产精品麻豆| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲精品乱久久久久久| 2021少妇久久久久久久久久久| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲第一青青草原| 国产一区二区三区综合在线观看| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 男女边吃奶边做爰视频| 999精品在线视频| 中文欧美无线码| 在线观看www视频免费| 欧美在线一区亚洲| 亚洲 欧美一区二区三区| 一级爰片在线观看| 在线天堂最新版资源| 国产 一区精品| 国产精品人妻久久久影院| av国产精品久久久久影院| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | av天堂久久9| 一区福利在线观看| 亚洲综合色网址| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 欧美乱码精品一区二区三区| 久久久久久久国产电影| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 精品久久久久久电影网| 国产成人免费无遮挡视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 在现免费观看毛片| 亚洲中文av在线| 国产精品免费大片| 久久亚洲国产成人精品v| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 久久久精品94久久精品| 九九爱精品视频在线观看| 日韩一本色道免费dvd| 成人三级做爰电影| 久久精品久久久久久久性| 久久av网站| 亚洲精品自拍成人| 国产视频首页在线观看| 久久人人爽人人片av| 高清在线视频一区二区三区| 天天操日日干夜夜撸| 国产在视频线精品| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 一级黄片播放器| 91aial.com中文字幕在线观看| 免费看av在线观看网站| 精品国产一区二区久久| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 色94色欧美一区二区| 国产精品三级大全| 国产乱来视频区| 成人亚洲精品一区在线观看| 精品一区二区免费观看| 午夜福利视频精品| 丁香六月天网| 精品免费久久久久久久清纯 | 黄频高清免费视频| 亚洲综合精品二区| 欧美在线一区亚洲| av女优亚洲男人天堂| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲天堂av无毛| 国精品久久久久久国模美| 好男人视频免费观看在线| 国产一区有黄有色的免费视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 在线观看国产h片| 日日啪夜夜爽| 最近最新中文字幕大全免费视频 | www.熟女人妻精品国产| 亚洲视频免费观看视频| 高清不卡的av网站| 国产成人精品在线电影| 成年人午夜在线观看视频| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产精品av久久久久免费| 色婷婷av一区二区三区视频| 2021少妇久久久久久久久久久| 精品人妻在线不人妻| av福利片在线| netflix在线观看网站| 国产一区有黄有色的免费视频| 精品一区二区三区四区五区乱码 | av有码第一页| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美av亚洲av综合av国产av | 免费少妇av软件| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久久久精品人妻al黑| 最近手机中文字幕大全| 国产成人精品久久二区二区91 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| 一区二区三区激情视频| 日韩制服骚丝袜av| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 免费少妇av软件| 十分钟在线观看高清视频www| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产极品天堂在线| 欧美国产精品va在线观看不卡| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 男女边吃奶边做爰视频| 波多野结衣av一区二区av| 午夜av观看不卡| 黄色视频在线播放观看不卡| 90打野战视频偷拍视频| 成人漫画全彩无遮挡| 久久毛片免费看一区二区三区| 丰满迷人的少妇在线观看| 女人久久www免费人成看片| 最近手机中文字幕大全| 亚洲人成电影观看| 在线观看www视频免费| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲成人手机| 亚洲熟女毛片儿| 国产黄色免费在线视频| 一二三四在线观看免费中文在| 久久99一区二区三区| 99九九在线精品视频| 老司机影院毛片| 中文字幕精品免费在线观看视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 高清不卡的av网站| 黄色一级大片看看| 我的亚洲天堂| av在线老鸭窝| 91aial.com中文字幕在线观看| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品一国产av| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 午夜福利乱码中文字幕| 91精品国产国语对白视频| 成年美女黄网站色视频大全免费| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲av男天堂| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久97久久精品| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 一边亲一边摸免费视频| 宅男免费午夜| 一本久久精品| 青草久久国产| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 极品人妻少妇av视频| av在线老鸭窝| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产高清国产精品国产三级| 国产精品久久久人人做人人爽| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲第一av免费看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 男人舔女人的私密视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲成人av在线免费| netflix在线观看网站| 天天添夜夜摸| 亚洲精品国产av成人精品| 久久精品人人爽人人爽视色| 9色porny在线观看| 在线精品无人区一区二区三| 人人澡人人妻人| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲精品国产一区二区精华液| videos熟女内射| 国产成人91sexporn| 久久久久久久大尺度免费视频| 99热国产这里只有精品6| av线在线观看网站| 欧美精品av麻豆av| 亚洲人成77777在线视频| 老司机在亚洲福利影院| 久久精品亚洲av国产电影网| 无遮挡黄片免费观看| 久久久久精品国产欧美久久久 | 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲,欧美精品.| 国产成人av激情在线播放| 宅男免费午夜| 天堂8中文在线网| 高清视频免费观看一区二区| 成人漫画全彩无遮挡| 久久久欧美国产精品| 久久久久精品国产欧美久久久 | a级毛片在线看网站| 午夜激情av网站| 麻豆av在线久日| 妹子高潮喷水视频| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲在久久综合| a级毛片黄视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 国产日韩欧美在线精品| 免费av中文字幕在线| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 久久久久人妻精品一区果冻| 尾随美女入室| 麻豆av在线久日| 国产亚洲一区二区精品| 日韩伦理黄色片| www.自偷自拍.com| 亚洲伊人久久精品综合| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 亚洲中文av在线| av卡一久久| 女人久久www免费人成看片| 精品久久久精品久久久| 天天操日日干夜夜撸| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 成人国产av品久久久| 国产精品久久久久久精品古装| 1024视频免费在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲精品自拍成人| 国产精品一二三区在线看| 午夜av观看不卡| 九九爱精品视频在线观看| 国产一区二区在线观看av| 国产成人系列免费观看| 国产视频首页在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| av不卡在线播放| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 蜜桃在线观看..| 欧美国产精品va在线观看不卡| 成人国产麻豆网| 国产精品久久久av美女十八| 国产视频首页在线观看| 黄色视频不卡| 国产在视频线精品| 男女边摸边吃奶| 一级黄片播放器| 制服诱惑二区| 亚洲精品国产av蜜桃| 欧美在线一区亚洲| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久99一区二区三区| 免费黄色在线免费观看| 国产精品一国产av| 99久久人妻综合| xxx大片免费视频| 尾随美女入室| 午夜日韩欧美国产| 在线观看免费日韩欧美大片|